超高效液相色谱-串联质谱法同时测定抗(抑)菌类消毒产品中苯海拉明和利多卡因的含量

林守二 ,邱文倩 ,陈佳丽 ,林 坚 ,华永有 ,杨 艳∗

(1.福建省疾病预防控制中心 福建省人兽共患病研究重点实验室,福州 350001;2.福建医科大学 公共卫生学院,福州 350004)

随着经济的发展和人们生活水平的不断提高,消毒产品品种和需求量日益增加。常见的消毒产品主要包括消毒剂、消毒器械、卫生用品和抗(抑)菌类产品等[1],其中抗(抑)菌产品在实际生活中应用越来越广泛。市售抗(抑)菌类消毒产品主要为含不同提取原料的霜膏等[2],用于治疗或缓解各类感染引起的不适。为了增强疗效与追求更高利益,不法商家可能非法添加抗生素、抗病毒药物、激素等[3-4],严重危害人类健康。我国现行消毒产品评审注册机制为安全评价备案,产品质量主要依靠市场监管保证。但是,目前尚缺乏抗(抑)菌类产品中各类违禁添加药物的全套检测方法的相关标准。为出台对应标准,方便监管部门监督抽检,维护消费者健康和权益,有必要建立抗(抑)菌类产品中各类违禁添加药物的检测方法。

苯海拉明与利多卡因是抗(抑)菌类产品中常见的违禁添加药物。苯海拉明是毒蕈碱乙酰胆碱受体的有效竞争性拮抗剂,是使用最广泛且使用时间最长的抗组胺药之一[5],具有抗过敏、镇静、消炎、止痒、消肿等作用[6],滥用易导致心脏毒性、中枢神经抑制、头晕、散瞳、过敏性休克等症状[7-8]。利多卡因是一种酰胺类麻醉药,在临床上被广泛用于局部麻醉和心律失常治疗,同时其还具有抗炎、抗菌、镇痛、抗肿瘤等作用[9]。药理研究结果表明,利多卡因可通过调节细胞内外离子浓度水平而改变跨膜电位和参与细胞信号转导过程[10]。过量使用利多卡因易引发高铁血红蛋白症、红斑、荨麻疹、皮炎,甚至紫癜等严重不良反应[11-12]。我国卫生部发布的«消毒产品生产企业卫生规范»明确指出,消毒产品禁止使用抗生素药物、抗真菌药物、激素等[13],但目前关于消毒产品中苯海拉明和利多卡因的测定方法尚未见报道。

消毒产品基质复杂,测定干扰大,建立一种高效、灵敏的检测方法至关重要。测定消毒产品中药物含量的常见方法有毛细管电泳法[14]、气相色谱法[15]、液相色谱法[16]和液相色谱-质谱联用法[17]等,其中超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLCMS/MS)具有灵敏度高、抗干扰能力强、快速、准确等优点,已用于复杂基质的人体样本中苯海拉明和利多卡因含量的测定[18-19]。本工作以市售84份抗(抑)菌类消毒产品为待测样品,通过优化前处理条件和仪器工作条件,采用UHPLC-MS/MS 同时测定抗(抑)菌类消毒产品中苯海拉明和利多卡因的含量,以期为消毒产品中违禁添加药物苯海拉明和利多卡因检测标准的制定提供方法参考,为规范消毒产品市场提供数据基础。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-三重四极杆质谱联用仪,包括Waters Iclass型超高压液相色谱系统和XEVO TQXS型质谱系统;Heidolph Multi Reax型自动旋涡混合器;Beckman Coulter Allegra X-30型离心机;SECURA125-1CN 型电子天平;Milli-Q 型超纯水机。

单标准储备溶液:100 mg•L－1,分别取适量苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10标准品,用甲醇溶解、稀释,摇匀备用。

单标准中间液:10.0 mg•L－1,取单标准储备溶液各1.00 mL,用甲醇稀释至10.0 mL,摇匀备用。

混合标准使用液:1.00 mg•L－1,取苯海拉明和利多卡因标准中间液各1.00 mL,用甲醇稀释至10.0 mL,于4 ℃冰箱中保存。使用时用甲醇稀释至所需的质量浓度。

混合内标使用液:1.00 mg•L－1,取苯海拉明-d3和利多卡因-d10标准中间液各1.00 mL,用甲醇稀释至10.0 mL,于4 ℃冰箱中保存。

混合标准溶液系列:取适量苯海拉明和利多卡因的混合标准使用液,用甲醇逐级稀释,各加入混合内标使用液10.0μL,配制成含10.0μg•L－1内标的0.50,1.00,2.00,5.00,10.0,20.0,40.0μg•L－1混合标准溶液系列。

苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10标准品的纯度均不小于98%;甲酸、甲醇、乙腈和正己烷为色谱纯;甲酸铵为优级纯;氯化钠为分析纯;试验用水为超纯水。

抗(抑)菌类消毒产品购于福州市各大药店,主要包括不同品牌的抑菌膏、抗菌膏、湿疹膏等,共84份,标记为样品1～84。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLCⓇBEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温30 ℃;流量0.25 mL•min－1;进样量2μL;流动相A 为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为甲醇。梯度洗脱程序:0～5.0 min 时,B 由10%上升至95%,保持1.5 min;6.5～7.0 min时,B由95%下降至10%,保持1.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)模式;离子源温度150 ℃;毛细管电压2.5 kV;脱溶剂气温度500 ℃,流量1 000 L•h－1;多反应监测(MRM)模式;苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量等质谱参数见表1,其中“∗”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS Parameters

1.3 试验方法

取抗(抑)菌类消毒产品样品0.200 g(精确至1 mg)于15 mL 离心管中,加入混合内标使用液100μL,涡旋混匀后静置30 min,用70%(体积分数,下同)乙腈溶液定容至5.00 mL。涡旋混合2 min,加入乙腈饱和的正己烷溶液1.0 mL 和氯化钠饱和溶液1.0 mL,超声提取20 min,涡旋15 min,于－20 ℃冰箱放置1 h。弃去上层正己烷相,取中间层相,加入等体积水稀释,以转速12 000 r•min－1离心5 min。取上清液过0.22μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的优化

分别在水性和油性基质空白样品中加入混合标准使用液,使加标量达到10.0μg•L－1,按照试验方法测定,考察了提取剂分别为乙腈、50%(体积分数,下同)乙腈溶液、70%乙腈溶液时对目标组分响应信号的影响,结果如图1所示。

图1 提取剂对不同基质样品中目标组分响应信号的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on the response signal of target components in samples with different matrices

由图1可知:采用70%乙腈溶液提取时,不同基质样品中的目标组分的响应信号均最高;采用50%乙腈溶液提取时,滤膜过滤阻力较大。因此,试验选择70%乙腈溶液作为提取剂,并加入乙腈饱和的正己烷溶液助溶。

2.2 净化条件的优化

分别在水性和油性基质空白样品中加入混合标准使用液,使加标量达到10.0μg•L－1,按照试验方法测定,考察了不加净化剂以及分别采用氯化钠饱和溶液、2 mmol•L－1硫酸锌溶液和C18净化(标记为净化条件1＃～4＃)时对目标组分回收率的影响,结果如图2所示。

图2 净化条件对不同基质样品中目标组分回收率的影响Fig.2 Effect of purification condition on the recovery of target components in samples with different matrices

由图2可知:对于水性基质样品,不同净化条件对利多卡因回收率的影响不大,以氯化钠饱和溶液净化时苯海拉明的回收率较大,推测氯化钠能够更好地促使水相中的目标组分进入有机相,但回收率较低(小于60.0%),需要采用内标法校正;对于油性基质样品,不净化或采用盐溶液净化所得目标组分的回收率均大于85.0%,采用C18净化时目标组分的回收率急剧下降,苯海拉明的回收率甚至降至10.0%以下,可能是C18在油性基质中更容易吸附目标组分。因此,试验选择采用氯化钠饱和溶液净化提取液。

2.3 流动相的优化

目标组分苯海拉明和利多卡因的最优电离模式均为ESI＋,在水相中加入0.1%甲酸有助于提高其离子化效率,增大其响应信号。试验还发现,相较于乙腈,以甲醇作为流动相时,目标组分的峰形更佳,因此试验选择的流动相为0.1%甲酸溶液-甲醇体系。

在最优仪器工作条件下,混合标准溶液、阴性样品溶液和阳性样品(59＃、20＃)溶液中目标组分及其内标的MRM 色谱图见图3。

图3 苯海拉明、利多卡因及其内标的MRM 色谱图Fig.3 MRM chromatograms of diphenhydramine,lidocaine and their internals

由图3可知:在混合标准溶液的色谱图中,两种目标组分达到完全分离,且峰形对称、响应较好,目标组分与各自内标的保留时间一致;阴性样品溶液的色谱图中未见明显色谱峰,且目标组分出峰位置附近无明显干扰;阳性样品溶液色谱中各目标组分的保留时间与混合标准溶液中的一一对应,说明分析过程较为稳定。

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以两种目标组分的质量浓度为横坐标,目标组分和内标定量离子峰面积的比值为纵坐标进行线性回归。结果显示:苯海拉明和利多卡因的质量浓度均在0.50～40.0μg•L－1内与对应的目标组分和内标峰面积比值呈线性关系,线性回归方程分别为y＝1.806×10－1x－9.295×10－3和y＝2.379×10－1x－9.736×10－3,相关系数分别为0.999 5 和0.999 2。

以3,10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果显示,苯海拉明和利多卡因的检出限分别为8.12,3.27μg•kg－1,测定下限分别为24.4,9.81μg•kg－1。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法处理加标阴性样品(加标量10.0μg•L－1),分别于同一天和连续3 天进样6次,计算峰面积比值的相对标准偏差(RSD)。结果显示,两种目标组分峰面积比值的RSD 分别小于3.2%(日内)和小于5.3%(日间),说明该方法的日内和日间精密度良好。

分别选取水性、油性基质的阴性样品作为待测对象,按照试验方法进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的RSD,结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:苯海拉明的回收率为96.2%～105%,利多卡因的回收率为88.5%～102%,苯海拉明的回收效果相对较好;水性、油性基质样品中两种目标组分的回收率分别为88.5%～99.5%和93.0%～105%,说明内标法显著提高了苯海拉明的回收效果,基质对于目标组分测定的影响较大,水性基质样品中两种目标组分的回收率低于油性基质样品中的;测定的RSD 为0.60%～3.5%,说明方法的精密度良好。

2.6 稳定性试验

制备加标水性和油性基质阴性样品溶液(加标量10.0μg•L－1),分别放置0,2,4,6,8,10,12,24,48 h后按照仪器工作条件测定,结果显示,放置不同时间后,不同基质样品中两种目标组分测定值的RSD 均小于6.2%,表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7 样品分析

按照试验方法分析84份市售抗(抑)菌类消毒产品样品,结果显示:各组分的保留时间与标准品的偏差的绝对值在2.5%以内,离子丰度比偏差的绝对值不超过欧盟2002/657/EC规定的允差范围,说明检测结果不是假阳性;在3份样品中检出了苯海拉明,测定值为9.10×103～2.86×106μg•kg－1,在1份样品中检出了利多卡因,测定值为117μg•kg－1,总检出率为4.76%,具体检出情况见热图(图4)。其中,绿色代表未检出,红色代表检出;红色深浅代表测定值大小,越浅代表测定值越小,越深代表测定值越大。

图4 样品检出情况热图Fig.4 Heat map of sample detection

由图4可知:苯海拉明和利多卡因是在4个不同样品中检出的,其中一份样品中苯海拉明测定值较高,达到106μg•kg－1级别,说明需要对市售消毒产品进行有效监督监测。

本工作以70%乙腈溶液作为提取剂,氯化钠饱和溶液进行净化,UHPLC-MS/MS 同时测定抗(抑)菌类消毒产品中苯海拉明和利多卡因的含量,具有一定的应用推广价值。