超高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠纹状体中多巴胺及其代谢物的含量

梁金良 ,陈晓彤 ,胡坤华

(1.中山大学附属第三医院 广东省肝脏疾病研究重点实验室,广州 510630;2.中山大学 中山医学院 蛋白质组学研究中心,广州 510080)

帕金森病(PD)作为世界上第二大神经退行性疾病[1],有大量研究表明该疾病与年龄呈正相关[2-5],影响了约1%的60 岁以上成年人[6]。随着人口平均年龄的增加,该疾病的患病率预计会持续上升。PD 患者常常表现出的症状有运动迟缓、静止性震颤、强直和姿势不稳等。自20世纪50年代发现多巴胺(DA)作为神经递质以来[7],PD 研究产生了丰富而复杂的知识体系。大脑黑质纹状体系统多巴胺能神经元能够产生大量DA 来调控其他脑区神经元,当多巴胺能神经元异常,DA 释放量会显著下降,这是导致PD 的直接原因[8-10]。目前PD 的治疗主要为DA 的替代药物或以深部脑刺激(DBS)或神经消融的形式进行手术[11-12]。然而,这些治疗是对症的,不能阻止PD 进展,并且可能与显著的副作用有关。因此,有必要对PD 的深层机制及临床治疗手段进行探索。

DA 作为重要的单胺类神经递质[13],亦是其他神经递质的前体[14-15],是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺。DA 及其代谢物高原儿茶酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量测定对PD 的研究与诊断具有重要的指导意义。然而,对生物样品中神经递质及其代谢物的定量分析仍面临许多挑战[16-18],如复杂的基质,化学性质不稳定以及浓度水平低等。目前对于神经递质常见的检测手段有高效液相色谱法联合紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器[19-21]以及液相色谱-质谱联用法[22-23]等,前几种方法存在灵敏度低、重复性差、样品需要衍生化及萃取富集等缺点,液相色谱-质谱联用法具有操作便捷、灵敏度高、进样量少等优点。因此,本工作采用超高效液相色谱-串联质谱法快速、灵敏、同时测定小鼠纹状体组织中多巴胺及其两种代谢物的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Vanquish型超高效液相色谱仪;TSQ Quantis型三重四极杆串联质谱仪;5427R 型高速冷冻离心机;Vortex-Genie2型旋涡混合器;KZ-III型高通量组织研磨仪;Milli-Q 型纯水机;TLE204 型电子天平。

单标准储备溶液:精密称取DA、DOPAC 和HVA 10.0 mg,用含0.1%(体积分数,下同)乙酸的甲醇溶液溶解并稀释至10 mL 容量瓶中,摇匀,配制成质量浓度为1 g•L－1的单标准储备溶液,置于－20 ℃保存备用。同法制备1 g•L－1的异丙肾上腺素内标(IS)储备溶液。

混合标准储备溶液系列:取适量的单标准储备溶液,置于同一容量瓶中,混匀,用含0.1%乙酸的甲醇溶液定容,配制成DOPAC 质量浓度分别为10,20,100,200,1 000,2 000,10 000,20 000μg•L－1,HVA 质量浓度分别为5,10,50,100,500,1 000,5 000,10 000μg•L－1,DA 质量浓度分别为1,2,10,20,100,200,1 000,2 000μg•L－1的混合标准储备溶液系列。

IS溶液:取适量的异丙肾上腺素标准储备溶液,用含0.1%乙酸-甲醇溶液稀释,配制成质量浓度为40μg•L－1的IS溶液。

盐酸多巴胺、DOPAC、HVA 的批号分别为BCBR4608V、BCBL7919V、BCCD8758;盐酸异丙肾上腺素的批号为1116D021。

甲酸、乙酸、甲醇、乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Gemini NX-C18色谱柱(150 mm×2 mm,3μm);柱温35 ℃;进样量5μL;流量0.3 mL•min－1;流动相A 为0.1%乙酸溶液,B为含0.1%乙酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～0.5 min时,B为2%;0.5～3.5 min 时,B 由2%升至98%,保持1.5 min;5.0～5.1 min时,B 由98%跳转至2%,保持1.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)、负离子(ESI－)模式;正离子喷雾电压3 500 V,负离子喷雾电压3 000 V;离子传输管温度300 ℃,气化室温度300 ℃;鞘气氮气,流量4.09 L•min－1;辅助气氮气,流量5.08 L•min－1;碰撞气为氩气;扫描方式为选择反应监测(SRM)模式。其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

精密称取小鼠纹状体约10 mg,加入200μL提取液2%(体积分数,下同)甲酸溶液,放入2 颗3 mm 钢珠,以功率60 Hz 低温研 磨60 s,研磨2次,以转速12 000 g•min－1于4 ℃离心15 min。取上清液80μL,分别加入IS溶液10μL和含0.1%乙酸的甲醇溶液10μL,涡旋混匀;再加入100μL甲醇涡旋,以转速12 000 g•min－1离心15 min,取上清液按照仪器工作条件测定。同步进行空白试验。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

DA 及其代谢物是典型的大极性小分子化合物,故试验在参照文献[24-25]报道的提取液基础上进行探索,以1%(体积分数,下同)甲酸溶液、含1%甲酸的甲醇溶液、2%甲酸溶液为提取液,考察了不同提取液对各目标物的提取效果。结果发现:以含1%甲酸的甲醇溶液为提取液时,DOPAC 出现峰宽的现象;以2%甲酸溶液为提取液时,目标物响应高于1%甲酸溶液的。因此,试验选择2%甲酸溶液为提取液,甲醇作为蛋白沉淀试剂。

2.2 色谱柱的选择

试验考察了 Hypersil GOLD(100 mm ×2.1 mm,1.9 μm)、Accucore PFP(100 mm ×2.1 mm,2.6μm)、Atlantis T3(100 mm×2.1 mm,3.0μm)、X Select CSH C18(100 mm×2.1 mm,2.5μm)和Gemini NX-C18(150 mm ×2 mm,3.0μm)等不同色谱柱对目标物的分离效果。结果表明:目标物为极性较大的小分子,在Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9μm)、Accucore PFP(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)与Atlantis T3(100 mm×2.1 mm,3.0μm)中表现出低保留,且不能使所有目标物出峰。而X Select CSH C18(100 mm×2.1 mm,2.5 μm)和Gemini NX-C18(150 mm×2 mm,3.0μm)色谱柱可以达到分离效果,X Select CSH C18色谱柱表面带电杂化颗粒(CSH),可使其表面带上少量的电荷,其柱效更高、目标物峰形更好,但是在分析样品时发现,样品基质的复杂性使目标物测定结果的重复性较差。Gemini NX-C18色谱柱所得目标物测定结果的重复性较好,且目标物响应能达到分析要求。因此,试验选择Gemini NX-C18色谱柱对目标物进行分离。

2.3 流动相的选择

DA 及其代谢物的液相色谱-质谱联用分析常用有机相为含0.1%乙酸的甲醇溶液和含0.1%乙酸的乙腈溶液[26-28]。试验发现,乙腈作为有机相时,DOPAC会出现严重拖尾,因此选用含0.1%乙酸的甲醇溶液作为有机相。试验还考察了0.05%(体积分数)甲酸溶液、0.1%(体积分数)甲酸溶液、0.05%(体积分数)乙酸溶液和0.1%乙酸溶液作为水相体系时对目标物的分离效果。结果发现,以0.1%乙酸溶液为水相体系时,所有目标物峰形都较好,其他水相体系会出现目标物宽峰的现象,因此选用0.1%乙酸溶液作为水相体系。

在优化的流动相体系下,标准溶液及小鼠纹状体组织样品加IS溶液的色谱图如图1所示。ESI＋模式下DA 与IS 的保留时间分别为0.98 min 和1.20 min,ESI－模式下DOPAC 和HVA 的保留时间分别为4.03 min和4.39 min。测定的总运行时间为7.00 min,表明方法快速、高效。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取离心管数支,分别加入提取液2%甲酸溶液80μL、IS溶液10μL 以及10μL 混合标准储备溶液系列,涡旋混匀。按照样品前处理方法进行操作,配制成DOPAC 质量浓度分别为0.5,1,5,10,50,100,500,1 000μg•L－1,HVA 质量浓度分别为0.25,0.5,2.5,5,25,50,250,500μg•L－1,DA 质量浓度分别为0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100μg•L－1的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件测定,以目标物的质量浓度为横坐标(x),以目标物峰面积(As)与IS峰面积(Ai)比值与空白提取液中目标物峰面积(A0)与IS峰面积(A0i)比值的差为纵坐标(y＝As/Ai－A0/A0i),采用最小二乘法建立线性回归方程,权重系数为1/x。所得的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数、检出限与测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以目标物定量离子的3倍信噪比(S/N)计算检出限,以目标物定量离子的10倍信噪比(S/N)计算测定下限,结果见表2。

2.5 精密度与回收试验

取小鼠纹状体组织,分别加入60,30,6μg•L－1的DA,300,150,30μg•L－1的HVA,600,300,60μg•L－1的DOPAC,按照样品前处理方法制备成高、中、低等3个不同浓度水平的加标样品。因空白对照组小鼠有限,且纹状体组织较小,样本量达不到每个浓度水平制作5个平行样品,故试验中每个浓度水平制作3个平行样品,将加标样品连续进样3 d,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),考察方法的日内精密度、日间精密度与准确度,结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果Tab.3 Results of test for precision and recovery

由表3可知,3种目标物的回收率为84.4%～117%,测定值的RSD 均小于15%,说明方法的准确度和精密度符合测定要求。

取高、中、低浓度水平的各一个加标样品,分别连续进样6次,计算测定值的RSD,考察仪器的精密度。结果显示,测定值的RSD 均小于5.0%,说明仪器精密度良好,稳定性良好,满足实验室测定要求。

2.6 样品稳定性

按照样品前处理方法制备高、中、低等3种浓度水平的质控样品,测定质控样品在自动进样器中放置8 h、4 ℃放置24 h以及－80 ℃放置30 d前后3种目标物的含量,计算放置前后测定值的相对误差(RE),结果见表4。

表4 多巴胺及其代谢物的稳定性结果Tab.4 Stability results of DA and its metabolites

结果表明:在4 ℃放置24 h前后的样品中DA测定值的RE 绝对值达到20%,但符合试验要求;上述条件下其他两种目标物及其他条件下3种目标物测定值的RE 绝对值均不大于17%。因此,在自动进样器中保存8 h、4 ℃保存24 h以及－80 ℃保存30 d的样品稳定性良好。

2.7 样品分析

采用试验方法对空白对照组和PD 模型组C57BL/6小鼠纹状体中的DA 及其代谢物进行测定,结果见表5。其中,“∗”代表P＜0.05,“∗∗”代表P＜0.001。

表5 小鼠纹状体中DA及其代谢物的测定结果(n＝4)Tab.5 Determination results of DA and its metabolites in striatum of mice(n＝4)

由表5可知,PD 模型组C57BL/6小鼠纹状体中DA、DOPAV 及HVA 的含量显著降低,表明PD模型组出现神经退行性现象。

本工作采用超高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠纹状体中DA 及其代谢物的含量。方法快速、可靠,重复性好,灵敏度高,可检测和量化小鼠纹状体中的DA、DOPAC和HVA,为小鼠纹状体DA 及其代谢物的含量测定提供了直接手段,有助于后续通过小鼠纹状体中DA 及其代谢物含量分布对PD模型验证以及治疗进行深入研究。