超高效液相色谱-串联质谱法测定毛发中7种新型苯二氮类策划药物的含量

郑新勇 ,曹广生 ,王辰雪 ,刘 宸 ,李旭阳 ,宋 昕∗

(1.合肥市公安局刑事科学技术研究所,合肥 230001;2.杭州谱育科技发展有限公司,杭州 310000)

在药物辅助犯罪案件中,受害者基本为单次用药,并且涉及的药物具有用量小、药效强、体内代谢快和含量低等特点,被害人恢复认知时,其血液和尿液可能已无法提供有效检材[8]。毛发具有检出时效长、易获取和易保存的优势,可以根据发丝的长度检测几周、几个月甚至几年前的药物信息[9-10]。液相色谱-串联质谱法因其具有灵敏度高、准确度好等特点而广泛应用于生物检材中痕量毒(药)物的测定[11-17]。目前国内外关于毛发中新型苯二氮类策划药物的测定报道较少,本工作采用湿法冷冻研磨结合超高效液相色谱-串联质谱法对毛发中瑞马唑仑、科纳唑仑、氟阿普唑仑、氟溴唑仑、玻玛唑仑、依替唑仑、溴替唑仑等7种新型苯二氮类策划药物进行测定,为新型苯二氮类策划药物辅助犯罪案件的侦破提供了相应的借鉴和参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ULC 510 型超高效液相色谱仪;EXPEC 5210型三重四极杆串联质谱仪;JXCL-6K 型三维离心冷冻研磨仪;CV400 型毒物检测浓缩仪,配JM50低温冷肼;Milli-Q Direct型纯水/超纯水一体化系统。

单标准储备溶液:0.1 g•L－1,瑞马唑仑、科纳唑仑、氟阿普唑仑、氟溴唑仑、玻玛唑仑、依替唑仑、溴替唑仑、阿普唑仑-d5的质量浓度均为0.1 g•L－1。

单标准溶液:10 mg•L－1,分别取适量的单标准储备溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为10 mg•L－1的单标准溶液。

混合标准溶液:100μg•L－1,取适量的各单标准溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为100μg•L－1的混合标准溶液,保存于4 ℃冰箱,使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

含内标提取剂:1μg•L－1,取适量的内标阿普唑仑-d5单标准溶液,用甲醇稀释至质量浓度为1μg•L－1,现配现用。

瑞马唑仑、科纳唑仑、氟阿普唑仑、氟溴唑仑、玻玛唑仑、依替唑仑、溴替唑仑、阿普唑仑-d5的纯度均不小于99%;甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Acquity UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温40℃;流动相A 为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为含0.1%甲酸的乙腈溶液;流量0.2 mL•min－1;进样量5μL。洗脱程序:0～4.0 min 时,B 为40%;4.0～7.0 min 时,B 由40%升至65%;7.0～8.0 min 时,B 由65%升至95%;8.0～9.0 min 时,B 由95%降至40%,保持2.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式扫描,多反应监测(MRM)模式检验;毛细管高压4.8 kV;去溶剂气温度480 ℃;雾化气流量1.2 L•min－1,去溶剂气流量6 L•min－1,反吹气流量1.2 L•min－1;碰撞气为高纯氮气,流量0.5 mL•min－1。其他质谱参数见表1,其中“∗”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

使用水、丙酮将毛发样品依次洗涤一次,置于洁净滤纸上晾干,之后将其剪碎至1～2 mm 长度备用。精确称取20 mg剪碎后的毛发于2 mL具盖研磨管中,加入1 mL 含内标提取剂,放入－50 ℃三维离心冷冻研磨仪中,预冷5 min后,冷冻研磨两次,每次90 s,中间间隔60 s,并以5 000 r•min－1转速离心5 min。待离心完毕后,取上清液,置于毒物检测浓缩仪中,浓缩至干,用100μL 甲醇复溶,过0.22μm 有机滤膜,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

图1 空白毛发样品中7种新型苯二氮类策划药物及内标的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatogram of 7 novel benzodiazepines and internal standard in blank hair sample

2.2 色谱柱的选择

试验比较了 kinetex Biphenyl 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)对7种新型苯二氮类策划药物的分离效果。结果表明:kinetex Biphenyl色谱柱分离效果较好,但是峰形和响应与Acquity UPLC HSS T3色谱柱相比较差;使用Acquity UPLC BEH C18色谱柱分析时,峰形和响应较好,但是分离效果与Acquity UPLC HSS T3色谱柱相比较差。因此,试验最终选择响应更高、峰形更好、分离效果更佳的Acquity UPLC HSS T3色谱柱。

2.3 流动相的选择

2.4 质谱条件的选择

配制质量浓度为100μg•L－1的氟阿普唑仑等7种新型苯二氮类策划药物及内标阿普唑仑-d5单标准溶液,采用ESI＋模式对每一种化合物的锥孔电压和碰撞能量进行优化。首先,将化合物在一级质谱全扫描(MS1 Scan)模式下采集,获得[M ＋H]＋分子离子峰,并优化出最优的锥孔电压;其次,将标准物质在二级质谱产物离子(Product ion)模式下采集,选取干扰小且响应较高的两个子离子,其中响应高的作为定量离子,响应低的作为定性离子;最后,将化合物在MRM 模式下采集,优化化合物的碰撞能量;并将响应最弱的化合物在MRM 模式下进行采集,对离子源的毛细管高压和去溶剂气温度等参数进行优化,进而获得最优的质谱条件。具体质谱条件见1.2.2节。

2.5 专属性试验

将20位健康志愿者所提供的毛发均按1.3节试验方法处理,在1.2节仪器工作条件下进行分析,考察了空白毛发对目标物的干扰。结果表明,在空白毛发基质中,7种化合物及内标的保留时间附近均未出现明显色谱峰,毛发基质中的内源性杂质不会对目标物及内标形成干扰,说明本方法具有较高的专属性。

2.6 基质效应

分别取空白毛发,按1.3节试验方法处理(此时提取剂为甲醇)获得空白基质提取液,用于配制质量浓度为5,50,250 pg•mg－1基质匹配的标准溶液,其中内标的质量浓度为50 pg•mg－1,测定相对峰面积;用甲醇配制5,50,250 pg•mg－1的标准溶液,其中内标的质量浓度为50 pg•mg－1,测定相对峰面积。通过相对峰面积比值评价基质效应带来的影响,结果见表2。

表2 基质效应Tab.2 Matrix effect

结果表明,在低、中、高3种浓度水平下,毛发中7 种新型苯二氮类策划药物的基质效应为87.7%～104%,说明方法基质效应不明显。但在公安案件理化检验实践中,为确保检材分析的准确度,应选择与检材具有一致性的空白基质进行同步处理,因此试验选择配制基质匹配的混合标准溶液系列来绘制后续的工作曲线。

2.7 工作曲线和检出限

以空白毛发为基质,分别制备1,2,5,10,20,50,100,200,500 pg•mg－1基质匹配的混合标准溶液系列,其中内标的质量浓度为50 pg•mg－1。按1.3节试验方法处理,在仪器工作条件下进行分析。以各目标物的质量分数为横坐标,定量离子色谱峰面积与内标定量离子色谱峰面积之比为纵坐标绘制工作曲线。结果表明,毛发中7种新型苯二氮类策划药物的质量分数在1～500 pg•mg－1内与定量离子色谱峰面积和内标定量离子色谱峰面积之比呈线性关系。具体的线性参数见表3。

表3 线性参数和检出限Tab.3 Linearity parameters and detection limits

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表3。

2.8 精密度和回收试验

分别对空白毛发在5,50,250 pg•mg－1低、中、高3个浓度水平上进行加标回收试验。每个加标浓度水平制备6份样品,按1.3节试验方法进行处理,在1.2节仪器工作条件下进行分析,结果见表4。在一天的早、中、晚三个时间段按回收率考察相同操作检验分析,计算相对峰面积的相对标准偏差(RSD),获得日内精密度。连续检验3 d,计算相对峰面积的RSD,获得日间精密度,结果见表4。

2.9 样品分析

2022年6月15日,某市张某某(女)被犯罪嫌疑人麻醉强奸,案发一周后在其家人陪同下报案,因距离案发时间太长,受害人血液和尿液已无法作为有效检材。一个月后,采集受害人从头皮至发梢2 cm 长度毛发,通过本方法检验后检出氟阿普唑仑,说明本工作建立的方法可用于实际工作中。

本工作以目前国内外增长较为迅速且对社会公共安全威胁较大的新型苯二氮类策划药物为对象,针对案件中常用易获得且具有监测长程用药信息的毛发检材,提出了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定毛发中7 种新型苯二氮类策划药物含量的方法。本方法专属性好、灵敏度高、准确度高,为公安机关在实际工作中打击新型苯二氮类策划药物滥用和药物辅助犯罪案件提供重要参考方法与技术支持。