肝激酶B1 在小细胞肺癌中的表达及与患者临床特征的关系△

张利娟，孟庆印，庄莉，龚泉，李雪芹，李仕娟，周春艳

昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院1康复与姑息医学科，2病理科，昆明 650118

肺癌是世界范围内发病率和病死率均较高的恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。其中，小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的发病率约占全部肺癌类型的15%[1]。与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）相比，SCLC 具有分化程度低、恶性程度高、早期易发生淋巴结转移和血行转移的特点，只有少数患者有手术切除的机会[2]。既往，靶向治疗为NSCLC 的治疗带来了显著进展，但SCLC的治疗方法却鲜有突破，对于大部分SCLC患者，目前主要的治疗手段仍然是化疗联合放疗[3]。尽管大多数SCLC 患者初始对化疗及放疗较为敏感，治疗效果较好，但很快就会产生耐药性或复发，限制了SCLC患者的总生存率，与NSCLC相比，SCLC患者的预后较差，是目前恶性肿瘤治疗的难点[4]。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）是1998 年被芬兰及德国学者在黑色素斑-胃肠道多发性息肉综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）患者中鉴定出来的抑癌基因[5]。LKB1 已被证实与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，但目前其与SCLC 关系的研究较少。本研究探讨LKB1 在SCLC 组织中的表达及与患者临床特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年5 月至2021 年12 月昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院收治的SCLC 患者。纳入标准：经术后（包括根治性手术及姑息性手术）病理学检查确诊为SCLC，均为首次接受治疗；年龄18～80 岁；TNM 分期为Ⅰ～Ⅳ期。排除标准：既往接受过抗肿瘤治疗；含有混合性病理成分；病历资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入45 例SCLC 患者，其中男37 例，女8 例；年龄30～73 岁，中位年龄60 岁；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期16 例；淋巴结转移18 例，无淋巴结转移27 例。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组化法检测LKB1 蛋白的表达情况

取45 例SCLC 患者的SCLC 组织及距肿瘤组织5 cm 以上的癌旁组织，连续4 μm 切片，采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫组化染色检测LKB1 蛋白的表达情况。一抗采用鼠抗人LKB1 单克隆抗体，二抗采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）单克隆抗体。采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，以已知阳性切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）作为阴性对照。

结果判定：采用双盲法对免疫组化结果进行判定，LKB1 蛋白主要定位于细胞质和细胞核，细胞质或细胞核呈棕黄色颗粒判定为阳性细胞，以染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。阳性细胞所占比例≤10%计0 分，阳性细胞所占比例11%～30%计1 分，阳性细胞所占比例31%～60%计2 分，阳性细胞所占比例＞60%计3 分；基本不染色计0 分，淡染色计1 分，棕黄色染色计2 分，棕黑色染色计3 分。将阳性细胞所占比例评分和染色强度评分相乘，0～1 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），其中4～6 分为中等阳性（++），＞6 分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所有数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LKB1 蛋白表达情况的比较

SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率为71.1%（32/45），明显低于癌旁组织的95.6%（43/45），差异有统计学意义（χ2=8.000，P＜0.01）。（图1）

图1 LKB1蛋白在SCLC组织中的表达情况（SP染色，×400）

2.2 不同临床特征SCLC 患者SCLC 组织中LKB1蛋白表达情况的比较

不同性别、吸烟史SCLC 患者SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；有淋巴结转移、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期SCLC 患者SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率分别低于无淋巴结转移、TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征SCLC 患者SCLC 组织中LKB1 蛋白表达情况的比较

3 讨论

SCLC 是最具侵袭性的肺癌，5 年生存率仅为6%[6]，SCLC 具有生长迅速和快速转移的特点，对多种治疗方法明显耐药[7]。目前，SCLC患者尚不能从靶向治疗中获益，即使是加入了免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI），SCLC 整体疗效的改善也并不理想[8-9]。SCLC的这一现状与NSCLC形成了鲜明的对比，在NSCLC 中，ICI 治疗和靶向治疗彻底改变了NSCLC 患者的生存结局[10]。因此，深入探讨SCLC 的发生、发展机制，寻找新的诊断及治疗靶点对SCLC 的防治有重要意义。抑癌基因LKB1已被证实在胃癌、肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达[11]。LKB1失活已被证明可以促进肿瘤的发展和转移，并改变对ICI 治疗的反应[12-16]。在NSCLC 样大细胞神经内分泌癌（large-cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC）的一个亚群中也发现了复发的丝氨酸/苏氨酸激酶11（serine/threonine kinase 11，STK11）突变[17]。相比之下，LKB1突变在SCLC 中尚未被确定为复发性事件，且对SCLC 中的LKB1 知之甚少[18]。有研究认为，SCLC 中不存在LKB1突变[19]，但亦有研究证实，SCLC 中存在LKB1突变[20]，因此，LKB1 与SCLC 之间的关系亟待进一步验证。目前关于SCLC 与LKB1 的国内外相关研究报道较少。本研究探讨LKB1 在SCLC 中的表达及与患者临床特征的关系。

本研究结果显示，SCLC 组织中LKB1 蛋白的阳性表达率为71.1%，明显低于癌旁组织的95.6%，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明SCLC 癌旁正常肺组织中LKB1 蛋白表达较高，LKB1 蛋白在SCLC 中可能具有一定程度的抑癌作用。进一步对临床特征的分析显示，不同性别、吸烟史SCLC患者SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；有淋巴结转移SCLC患者SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率低于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明在SCLC 中，LKB1 蛋白的表达可能与淋巴结转移有关，LKB1 蛋白阳性表达率较低的患者淋巴结转移率较高，LKB1 蛋白可能在一定程度上抑制了SCLC 的淋巴结转移。本研究结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期SCLC 患者SCLC 组织中LKB1 蛋白阳性表达率低于TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明LKB1 蛋白的表达与SCLC 发展进程有关。

本研究结果证实了LKB1 蛋白在SCLC 发生发展中的重要作用，这与Sivakumar 等[21]的研究结果相符，该研究对3600 例SCLC 患者多达324 个肿瘤相关基因的外显子进行深度测序，发现了其中62例患者存在LKB1基因突变，占整个研究人群的1.7%，降低了这些患者的生存率。因此，有研究将LKB1突变作为SCLC 的一种新的基因亚型，更令人惊讶的是，有研究分析256 例非洲SCLC 患者的病历资料分析发现，这些患者多数为RB1、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）野生型和LKB突变型，表明LKB突变型可能与不同种族有关。本研究结果显示，SCLC 组织中LKB1 蛋白的阳性表达率为71.1%，LKB1 蛋白表达情况与SCLC 患者淋巴结转移及TNM 分期有关，提示LKB1 可能作为SCLC 的潜在诊断、治疗和预后评估靶点，有望为SCLC 患者带来新的治疗希望。LKB1 蛋白在SCLC 组织中低表达的原因尚不能完全明确，除基因突变外是否还有其他机制，LKB1 低表达在SCLC 中发生发展过程中所发挥的作用及相关信号通路尚未完全阐明，中国人群中LKB1突变情况如何等问题也有待进一步研究。

综上所述，LKB1 蛋白在SCLC 中低表达，其表达与淋巴结转移和TNM 分期有关，有望作为SCLC 患者潜在的治疗靶点和预后评估指标。