胆瘀方药液对大鼠主动脉内皮细胞脂质泡沫化的抑制作用及其机制

宋晓龙，潘仁友，涂冬云，顾月星，宋峻，伍德明，倪其猛

南京中医药大学附属盐城中医院 盐城市中医院心内科，江苏盐城 224001

冠心病（CHD）最核心的发病机制就是动脉粥样硬化（AS），本质上是一种大、中动脉内膜慢性持续进展的炎症性血管病变［1-2］。在AS 早期即可出现内皮细胞损伤，造成巨噬细胞在血管内皮细胞聚集，低密度脂蛋白（LDL）开始沉积，内皮细胞被氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）激活，吸引吞噬细胞向内膜中积聚，大量释放促炎细胞因子，导致更多炎症细胞浸润和平滑肌增生，从而加速AS 的启动［3］。胆瘀方是我科室团队基于胸痹心痛病的中医理论研究所创立，由温胆汤和丹参饮加减而成，具有健脾化痰降浊、益气活血化瘀等功能，常用于治疗冠心病心绞痛，临床疗效显著［4］。2022 年8 月—2023 年5 月，本研究以Ox-LDL 刺激大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）脂质泡沫化模拟AS的内皮细胞，探讨胆瘀方药液对内皮细胞脂质泡沫化的抑制作用及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：RAECs 购自美国Cell 公司，使用含有10%胎牛血清、100 µg/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM 完全培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。胆瘀方：丹参20 g、水蛭3 g、半夏12 g、竹茹12 g、陈皮6 g、黄芪20 g、茯苓10 g、檀香3 g、砂仁3 g、枳实12 g、桔梗6 g、炙甘草3 g；加入2 L 水浸泡1 h 后煎煮1 h，过滤后再加入2 L 水煎煮50 min，再次过滤；将两次煎煮的滤液继续煎煮浓缩至浓度2 g/mL的药液。主要试剂：肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 检测试剂盒及蛋白质酪氨酸激酶2（JAK2）、信号转导与转录激活因子3（STAT3）、p-JAK2、p-STAT3 抗体均购自北京碧云天生物技术有限公司，活性氧（ROS）检测试剂盒购自中国北京百奥莱博科技有限公司，JAK2、STAT3 引物序列均由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 Ox-LDL 作用浓度确定 选择对数生长期的RAECs，以1 × 104/孔接种于96 孔板中，使用DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。①细胞增殖能力检测：取RAECs，分别加入不同浓度（0、50、100、150、200 µg/mL）Ox-LDL 作用24、48、72 h，使用CCK-8 试剂盒检测细胞活力，上酶标仪检测450 nm波长处的OD 值，实验重复3 次取平均值。结果显示：与0 µg/mL Ox-LDL 作用相同时间点比较，150、200 µg/mL Ox-LDL 作用48、72 h 的OD 值均降低（P均＜0.01），以200 µg/mL Ox-LDL 作用72 h 的OD值降低幅度最大。见表1。②细胞脂质泡沫化情况观察：取RAECs，分别加入不同浓度（0、50、100、150、200 µg/mL）Ox-LDL 作用72 h。将油红O 粉末溶解在异丙醇中，用蒸馏水将油红O 原液稀释至0.3%，并通过0.22 µm 过滤器过滤。室温下4%多聚甲醛固定1 h，油红O 溶液进行染色，5 min 后显微镜下观察，含有油红O 阳性脂肪滴的细胞为泡沫细胞。结果显示，200 µg/mL Ox-LDL 作用72 h 的RAECs脂质泡沫化程度最高。见OSID码图1。

表1 RAECs经不同浓度Ox-LDL作用不同时间后的细胞增殖能力比较（）

表1 RAECs经不同浓度Ox-LDL作用不同时间后的细胞增殖能力比较（）

注：与0 µg/mL Ox-LDL作用相同时间比较，*P＜0.05，#P＜0.01。

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1.3 细胞分组及不同剂量胆瘀方处理 选择对数生长期的RAECs，以1 × 104/孔接种于96 孔板中，使用DMEM 培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将RAECs 随机分为六组，即对照组、模型组、胆瘀方低剂量组、胆瘀方中剂量组、胆瘀方高剂量组及阿托伐他汀组。除对照组外，其余五组均给予200 µg/mL的Ox-LDL灌胃作用72 h，胆瘀方低、中、高剂量组及阿托伐他汀组分别给予50、100、200 µg/L 胆瘀方药液及阿托伐他汀300 µg/L灌胃。

1.4 细胞增殖能力检测 参照“1.2”，采用CCK-8法检测各组分组处理后24、48、72 h 的OD 值，以此表示细胞增殖能力。

1.5 细胞脂质泡沫化情况观察 取分组处理后72 h 的各组细胞，采用油红O 染色观察各组细胞脂质泡沫化情况。

1.6 细胞TNF-α、IL-6 蛋白检测 采用ELISA 法。取分组处理72 h 的各组细胞，使用ELISA 检测试剂盒检测TNF-α、IL-6 表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 细胞ROS 含量检测 采用二羟甲基荧光素（DCFH-DA）氧化荧光反应。取分组处理后72 h 的各组细胞，以5 × 104/mL 接种在6 孔板中，除去培养基。加入DCFH-DA 荧光探针1.5 mL，37 ℃条件下作用25 min。200 倍荧光显微镜下观察细胞荧光情况，以此表示ROS含量。

1.8 细胞上清液MDA和SOD水平检测 采用ELISA法。取分组处理72 h 的各组细胞，置于冷生理盐水中，匀浆机匀浆，3 000 r/min离心15 min，分离细胞上清液。使用ELISA试剂盒检测细胞上清液MDA、SOD表达，严格按照试剂盒说明书操作。

1.9 细胞JAK2、STAT3 mRNA 检测 采用实时荧光定量PCR 法。取分组处理72 h 的各组细胞，使用TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA。JAK2 引物序列：上游引物5′-AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-3′，下游引物5′-AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT-3′；STAT3引物序列：上游引物5′-ACCAGCAGTATAGCCGCTTC-3′，下游引物5′-GCCACAATCCGGGCAATCT-3′；内参GAPDH引物序列：上游引物5′-GGTTTGAGCAGGTTTTT-3′，下游引物5′-GATGCCTGCTTCACCACC-3′。在MyiQ2 PCR 热循环仪上进行PCR 反应，2-ΔΔCt法计算JAK2、STAT3 mRNA相对表达量。

1.10 细胞JAK2、STAT3 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 检测 采用Westen blotting 法。取分组处理72 h的各组细胞，加入RIPA缓冲液裂解细胞，检测总蛋白浓度合格。10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入含有0.05%吐温20的Tris缓冲盐水（TBS）稀释的奶粉，阻断非特异性位点。加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 及内参GAPDH 的兔单克隆一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗涤3次；加入山羊抗兔IgG二抗（稀释比例均为1∶ 2 000），37 ℃条件下孵育1 h。采用增强化学发光法评价印迹，Quantity One软件分析条带灰度值，计算JAK2、STAT3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。

1.11 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料采用Cramer-von Mises test（CVM 检验）正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 与对照组作用相同时间点比较，模型组OD 值均降低（P均＜0.05）；与模型组作用相同时间点比较，胆瘀方高剂量组及阿托伐他汀组OD 值均升高，胆瘀方中剂量组作用48、72 h的OD值均升高（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组不同时间点细胞增殖能力比较（）

表2 各组不同时间点细胞增殖能力比较（）

注：与对照组作用相同时间比较，*P＜0.05；与模型组作用相同时间比较，#P＜0.05；与阿托伐他汀组作用相同时间比较，△P＜0.05。

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2.2 各组细胞脂质泡沫化情况比较 对照组细胞无脂质泡沫化情况，模型组细胞脂质泡沫化明显；与模型组比较，阿托伐他汀组及胆瘀方高、中、低剂量组细胞脂质泡沫化均得到改善，胆瘀方高剂量组和阿托伐他汀组细胞脂质泡沫化缓解最明显，几乎趋近于对照组。见OSID码图2。

2.3 各组细胞TNF-α、IL-6、ROS 及上清液MDA、SOD 表达比较 与对照组比较，模型组细胞TNF-α、IL-6、ROS 及上清液MDA 表达均升高，上清液SOD表达降低（P均＜0.05）。与模型组比较，阿托伐他汀组及胆瘀方高、中、低剂量组细胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA 表达均降低，上清液SOD 表达均升高，以阿托伐他汀组及胆瘀方高剂量组变化更明显（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA、SOD表达比较（）

表3 各组细胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA、SOD表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阿托伐他汀组及胆瘀方高剂量组比较，△P＜0.05。

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2.4 各组细胞JAK2、STAT3 mRNA、蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比较 与对照组比较，模型组细胞JAK2、STAT3 mRNA 相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均升高（P均＜0.05）。与模型组比较，阿托伐他汀组及胆瘀方高、中、低剂量组细胞JAK2、STAT3 mRNA 相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均降低，以阿托伐他汀组及胆瘀方高剂量组降低更明显（P均＜0.05）。各组细胞JAK2、STAT3蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表4及OSID码图3。

表4 各组细胞JAK2、STAT3 mRNA、蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阿托伐他汀组及胆瘀方高剂量组比较，△P＜0.05。

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3 讨论

AS是动脉硬化中最常见的类型，在人体重要器官均可发生，并且在引起急性心脑血管疾病（如心梗和脑梗）之前可以很多年都没有临床症状。AS主要表现为大、中动脉内膜的脂质沉积、平滑肌细胞和基质增生，炎症细胞浸润，内膜增厚，血栓形成，最终导致管腔狭窄，严重时会出现闭塞［5］。冠状动脉一旦发生AS，其损伤数量随年龄增加，管腔出现不同程度狭窄，并伴有血栓形成，导致血液循环障碍［6-7］。因此，人体出现AS 后需要积极治疗，防止斑块进展［8-9］。阿托伐他汀是治疗AS 的常用药物，其治疗作用已被临床证实［10］，因此本研究选择阿托伐他汀作为阳性对照药物。越来越多的研究表明，部分中药或者中药成分能够用于治疗AS［11-12］。胆瘀方是我科治疗冠心病心绞痛的经验方，方中半夏燥湿化痰，竹茹清热化痰，陈皮理气健脾、燥湿化痰；丹参、水蛭活血化瘀、搜风剔络；茯苓、黄芪健脾益气、利水祛湿，可杜生痰之源；治痰治血先理气，气顺则痰化瘀消，方中檀香、砂仁、桔梗、枳壳均具有宽胸理气之功效，以助化痰活血；甘草调和诸药；诸药配伍，共奏健脾化痰降浊、益气活血化瘀之效。但是，胆瘀方的作用机制，尤其是其治疗AS的作用机制尚不清楚。

在AS发生发展过程中，起到关键性作用的内皮细胞除了建立屏障与运输营养物质外，还具有调节内分泌功能，具有预防血栓、调节血管舒缩和局部血流，降低血管通透性，调节免疫反应和炎症，促进血管新生，抑制细胞迁移和增殖等作用［13］。此外，内皮细胞作为一类传递信号的细胞，当细胞膜受体感知到化学性或者物理性变化后，会分泌多种生物活性物质［14］。当血管内皮细胞受到各种AS 病理因子的反复刺激后，其结构功能遭到破坏，通透性增强，导致动脉硬化的大分子物质如LDL 随即进入内皮下间隙，氧化后被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞［15］；同时，内皮细胞的代谢功能也随之发生变化，通过释放各种细胞因子发挥促进炎症和凝血的作用，从而形成血栓，最终导致相关疾病发生［16］。因此，内皮细胞功能异常不仅是AS形成之前的一个早期表现，更是重要的启动及致病因素之一［17］。本研究以Ox-LDL刺激RAECs 脂质泡沫化模拟发生AS 的内皮细胞，并采用不同剂量胆瘀方进行处理；结果显示，高剂量胆瘀方处理后细胞增殖能力升高，且脂质泡沫化情况比较轻，几乎趋近于对照组；这提示高剂量胆瘀方可以提高Ox-LDL 刺激后RAECs 的增殖能力，并减轻其脂质泡沫化。

炎症反应参与了AS 的各个阶段，贯穿AS 不同阶段损伤，其中IL-6、TNF-α 是最重要的炎症因子。IL-6 在AS 的炎症反应中起核心调节作用，是参与AS 形成的一个重要炎症因子，与AS 斑块的稳定性密切相关［18］。TNF-α是一种对多种细胞的生长分化等功能发挥抑制或刺激效应的因子，其主要生物学活性为激活炎症反应。TNF-α可刺激内皮细胞合成E-选择素，激活平滑肌细胞产生IL-6［19］。研究发现，TNF-α、IL-6 可促使内皮细胞产生ROS，使众多促炎因子表达增加，炎症反应与细胞增殖形成恶性循环，促进AS 斑块生长并导致其稳定性下降［20］。本研究结果显示，Ox-LDL刺激后的RAECs TNF-α和IL-6表达均升高，经过胆瘀方及阿托伐他汀处理后均降低，以高剂量胆瘀方及阿托伐他汀作用最明显；这提示高剂量胆瘀方能够降低AS 过程中内皮细胞的炎症反应。

ROS 累积负荷会扰乱氧化还原的动态平衡，损伤细胞内DNA、脂类和蛋白质等细胞大分子，导致生物膜脂质受到过氧化损伤，进而损伤内皮细胞，减少内皮细胞的一氧化氮合成与生物利用度［21］。氧化应激还可激活细胞内多种转录因子表达，使炎症因子和趋化因子表达升高，引起动脉内皮细胞的损伤［22］。MDA 是ROS 攻击细胞膜所形成的脂质过氧化代谢终产物，其含量可反映机体脂质过氧化的程度，MDA 升高提示氧化应激损伤加重，反之则说明氧化应激损伤减轻［23］。SOD具有清除生物体内超氧阴离子自由基的作用，对维持细胞内环境的稳态、保护血管内皮免受过氧化损伤等发挥重要作用。研究显示，SOD活性增强能抑制细胞介导的LDL过氧化，减少Ox-LDL 形成，阻止巨噬细胞对脂类的过度摄取，减少泡沫细胞形成，SOD变化可反映细胞遭受氧化应激的水平［24］。本研究结果显示，Ox-LDL刺激后RAECs ROS 和MDA 表达均升高、SOD 表达降低，经过胆瘀方及阿托伐他汀处理后ROS 和MDA 表达均降低、SOD表达升高，以高剂量胆瘀方及阿托伐他汀作用最明显；这提示高剂量胆瘀方可减轻Ox-LDL引起的内皮细胞氧化应激损伤。

JAK2/STAT3 通路最开始是在肿瘤微环境中被发现，近年来研究发现其对炎症反应具有重要影响，可以引起IL-6、TNF-α 等下游炎症因子表达［26］。抑制JAK2/STAT3 通路激活可有效缓解AS 患者的组织炎症反应，抑制炎症因子分泌，有效抑制高脂饮食诱发的AS［25］。JAK2 和STAT3 的磷酸化是调节蛋白质活力和功能的最核心机制，是蛋白具有生物学活性的重要标志，提示JAK2/STAT3 通路处于激活状态。本研究结果显示，Ox-LDL刺激后RAECs JAK2、STAT3 mRNA 相对表达量及p-JAK2/JAK2 、p-STAT3/STAT3 均升高，胆瘀方能够有效降低上述指标，而各组细胞JAK2、STAT3 蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义；这提示Ox-LDL 刺激后RAECs 的JAK2/STAT3 信号通路被激活，而胆瘀方能够抑制JAK2/STAT3信号通路激活。

综上所述，胆瘀方药液可抑制Ox-LDL 诱导的RAECs 脂质泡沫化，以高剂量胆瘀方药液作用更明显，其机制可能与抑制炎症反应、氧化应激反应及JAK2/STAT3信号通路有关。