霍山石斛多糖对帕金森病小鼠运动障碍、神经元受损及星形胶质细胞衰老的改善作用

张培，董健健，徐陈陈，汪世靖，程楠

1 安徽中医药大学神经病学研究所，合肥 230038；2 安徽中医药大学神经病学研究所附属医院神经内科

帕金森病（PD）以黑质多巴胺能神经元变性死亡、纹状体多巴胺含量减少和神经元内异常蛋白聚集为主要病理特征，是继阿尔茨海默病（AD）之后第二常见的神经退行性疾病［1］。PD 发病机制众多，目前已有研究表明星形胶质细胞功能障碍会导致PD的神经变性［2］。细胞衰老在PD 发生中具有重要作用，衰老细胞会出现生长停滞的现象，且会分泌衰老相关分泌表型（SASP）分子，从而影响周围细胞［3］。研究显示，延缓星形胶质细胞的衰老可以改善AD小鼠的认知功能，清除衰老细胞能够减轻PD小鼠的神经变性［4-5］。因此，靶向衰老的星形胶质细胞可能是治疗PD 的一种策略。霍山石斛多糖（DHP）是从霍山石斛中提纯的具有高度生物活性的一种物质，是石斛发挥功效的主要物质基础。DHP 具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗氧化以及抗衰老等广泛的药理作用［6-9］。本课题组前期研究发现，DHP 可以改善PD小鼠的神经损伤，但关于其机制还需要进一步了解［10］。2022 年12 月—2023 年7 月，本研究采用体外和体内实验来探讨DHP 对PD 小鼠运动障碍、神经元受损及星形胶质细胞衰老的抑制作用，为研究PD的发病机制及治疗策略提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人神经母瘤SH-SY5Y 细胞购自合肥苗茁生物科技有限公司，细胞培养于含10%FBS、1%青—链霉素的MEM/F12 培养基中，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每2～3 d传代1次；小鼠星形胶质细胞C8-D1A 购自凯基生物科技有限公司，培养于含10% FBS、1%青—链霉素的DMEM 高糖培养基中，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每2～3 d传代1次。实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠40 只，8 周龄，体质量23～25 g，购自江苏华创信诺医药科技有限公司，动物合格证号2023061906；饲养于安徽中医药大学实验动物中心，12 h光/暗循环，温度20～22 ℃，湿度50%～60%，本研究通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审核（AHUCMmouse-2020025）。主要试剂：DHP（纯度60%）购自上海源叶生物科技有限公司，细胞噻唑蓝（MTT）购自赛国生物科技有限责任公司，1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）均购自美国Sigma 公司，β-微管蛋白（β-tubulin）兔单克隆抗体购自成都正能生物技术有限公司，酪氨酸羟化酶（TH）、衰老标志物核纤层蛋白B1（Lamin B1）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）抗体均购自英国Abcam 公司，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（β-gal）染色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，实时荧光定量PCR 检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16INK4a、基质金属蛋白酶3（MMP-3）引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 体内实验

1.2.1 PD 小鼠模型构建及分组给药 将DHP 用ddH2O稀释，60 ℃水浴加热至完全溶解，分别配置成浓度为5、17.5 kg/L 的溶液。40 只雄性C57BL/6 小鼠适应性饲养1 周，随机分为NC 组、MOD 组、DHP100 组、DHP350 组，每组10 只。MOD 组、DHP100 组、DHP350 组腹腔注射30 mg/kg 的MPTP 0.2 mL，1 次/天，连续5 d，建立PD 小鼠模型［11］；NC组腹腔注射等体积生理盐水，1 次/天，连续5 d。DHP100 组、DHP350 组建模后分别灌胃给予100、350 mg/kg的DHP各0.5 mL，1次/天，连续2周［10］。

1.2.2 运动能力观察

1.2.2.2 悬挂实验 将一根直径为1.5 mm的金属棒水平放置在距底部30 cm 的开口箱上方。将小鼠前爪悬挂在金属棒上，记录小鼠悬挂至着陆前的时间，即为悬挂时间。实验每隔1 min 进行1 次，共3 次，取平均值。

1.2.2.3 平衡木实验 取一根长1 m、宽度14 mm的方形平衡木。平衡木一端是60瓦的灯泡，用于将光线照射到起点上方，作为令小鼠反感的刺激源，另一端是黑色暗盒。正式测试前两天，每天训练小鼠通过平衡木进入黑色暗盒，3 次/天，每次间隔2 h。第三天为正式测试，记录小鼠在60 s 内通过平衡木进入黑色暗盒内的时间，即为通过时间。若未能到达暗盒，则记为60 s。

1.2.3 小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）和星形胶质细胞Lamin B1 检测 采用免疫荧光法。四组小鼠麻醉取脑，石蜡切片、烘烤、脱蜡后，0.3% Triton X-100 打孔5 min。5%正常驴血清封闭1 h，加入特异性一抗孵育过夜，荧光二抗室温孵育2 h，共定位的两种二抗按比例混合，含DAPI 的封片剂封片，闭光保存，镜检拍照。DAPI染出来的细胞核在紫外光激发下为蓝色，TH和星形胶质细胞阳性表达为相应荧光素标记的红色，Lamin B1 为绿色。高倍镜下随机选取6个视野，计数中脑黑质TH染色阳性细胞数，分析星形胶质细胞中Lamin B1的荧光表达量。

1.2.4 小鼠中脑Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白检测采用Western blotting 法。取四组小鼠中脑组织，经裂解、离心后，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热8 min，-80 ℃冰箱保存。十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转移到NC 膜上。4 ℃条件下，用含5%脱脂奶粉的PBST 封闭液摇床孵育过夜；PBST 缓冲液洗涤，加入一抗常温摇床孵育4 h，PBST 缓冲液洗涤，将NC 膜与二抗常温摇床孵育1.5 h。使用化学发光试剂盒进行曝光，Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白Tubulin 灰度值的比值计算目的蛋白相对表达量。

1.2.5 小鼠中脑p16INK4a、MMP-3 mRNA 检测采用实时荧光定量PCR 法。取四组小鼠中脑组织，加入TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录获得cDNA。使用引物和探针进行PCR 反应。p16INK4a引物序列：上游引物5′-GGACATCAAGACATCGTGCG-3′，下游引物5′-TTGAGCTGAAGCTATGCCCG-3′；MMP-3引物序列：上游引物5′-GGCCTGGAACAGTCTTGGC-3′，下游引物5′-TGTCCATCGTTCATCATCGTCA-3′；内参GAPDH 引物序列：上游引物5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，下游引物5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.3 体外实验

1.3.1 MPP+半数有效浓度确定 采用MTT 法。将C8-D1A 细胞以3 × 103/孔接种于96 孔板，当细胞生长至60%时，吸弃培养基，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmo1/L 的MPP+。MPP+作用24 h 后，避光条件下每孔加入MTT 溶液20 µL，继续培养4 h。避光条件下每孔加入DMSO 溶液150 µL，酶标仪测定450 nm 处各孔吸光度。细胞存活率 = （给药孔吸光度 - 空白孔吸光度）/（对照孔吸光度 - 空白孔吸光度） × 100%。结果显示，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmo1/L MPP+的C8-D1A 细胞存活率分别为100.00% ± 7.22%、63.47% ± 3.70%、54.57% ± 4.52%、49.66% ± 5.39%、48.28% ±6.40%、42.13% ± 7.65%。确定MPP+的半数有效浓度为0.6 mmo1/L，以该浓度进行后续实验。

1.3.2 DHP 最佳作用浓度确定 采用MTT 法。将C8-D1A 细胞以3×103/孔接种于96 孔板，当细胞生长至60%时，吸弃培养基。加入0、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/mL 的DHP 100 µL，作用12 h 后，加入0.6 mmo1/L MPP+作用24 h。以未经处理的C8-D1A细胞作为正常对照，参照“1.3.1”进行MTT 检测。结果显示，正常对照细胞及加入0、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/mL DHP + 0.6 mmo1/L MPP+的C8-D1A细胞存活率分别为100% ± 5.10%、53.71% ±6.44%、68.22% ± 8.24%、78.51% ± 5.76%、72.14% ± 3.67%、86.23% ± 6.99%、82.29% ±5.47%、76.32% ± 4.99%、71.80% ± 6.79%、62.71% ± 7.40%，C8-D1A 细胞经0.6 mmo1/L MPP+作用后的细胞存活率降低，加入不同浓度DHP 预处理的细胞存活率升高，以8 µg/mL DHP 作用最明显（P均＜0.05）。确定DHP的最佳作用浓度为8 µg/mL，以该浓度进行后续实验。

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1.3.3 细胞分组处理 DHP用DMEM培养基稀释，超声波辅助溶解，参数设置为温度37 ℃、时间120 min、超声频率90 kHz，离心速率3 000 r/min，微孔滤膜针式过滤器过滤，配制12 µg/mL 母液，现用现配。将C8-D1A 细胞分为三组，正常组用不含血清的DMEM培养液进行培养，模型组用0.6 mmol/L MPP+作用24 h构建PD 细胞模型，DHP 组用8 µg/mL DHP 预处理12 h后加入0.6 mmol/L MPP+作用24 h。

1.3.4 细胞培养基对SH-SY5Y 细胞活力的影响观察 采用MTT 法。将SH-SY5Y 细胞以5 × 104/孔接种于96孔板，当细胞生长至90%时，吸弃培养基，分别加入正常组、模型组、DHP 组的细胞培养基，每组均设6 个复孔。作用24 h 后，参照“1.3.1”进行MTT检测，计算细胞存活率。

1.3.5 细胞周期观察 采用流式细胞术。收集三组细胞培养液，PBS 清洗，胰酶消化细胞，用培养液终止消化。1 000 r/min 离心5 min，去上清，加1 mL预冷的PBS 重悬细胞，转移到1.5 mL 离心管中再次离心，去上清。轻弹管底以适当分散细胞，避免成团。加入1 mL预冷的70%乙醇，吹打混匀，4 ℃固定12 h。1 000 r/min 离心5 min，去上清。再次加入1 mL 预冷的PBS，重悬细胞、离心、去上清。轻弹管底以适当分散细胞，避免成团。避光条件下配制染色液，每管样品加0.5 mL 染色液，缓慢并充分重悬细胞。37 ℃避光孵育30 min，4 ℃避光存放。24 h内上流式细胞仪，分析细胞周期比例。

1.3.6 细胞β-gal 阳性检测 取各组细胞，吸除细胞培养液，PBS 洗涤1 次，加入β-gal 染色固定液1 mL，室温固定15 min。吸除细胞固定液，PBS 洗涤3 次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入染色工作液1 mL，37 ℃孵育过夜。β-gal 阳性细胞染为蓝色，显微镜下观察并计算β-gal阳性率。

1.3.7 细胞端粒酶表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取三组细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录获得cDNA。使用实时荧光定量PCR 端粒酶检测试剂盒（小鼠）进行25 µL 体系的实时定量PCR检测，严格按照试剂盒说明书操作。将样品和每个引物加入PCR反应系统，并进行定量分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠行为学实验结果比较 与NC 组比较，MOD 组停留时间、悬挂时间均缩短，通过时间均延长（P均＜0.05）；与MOD 组比较，DHP100 组、DHP350 组停留时间、悬挂时间均延长，通过时间均缩短，且DHP350 组停留时间、通过时间变化更明显（P均＜0.05）。见表1。

表1 四组小鼠停留时间、悬挂时间及通过时间比较（s，）

表1 四组小鼠停留时间、悬挂时间及通过时间比较（s，）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05；与DHP100组比较，△P＜0.05。

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2.2 四组小鼠中脑TH 阳性神经元数量、Lamin B1、IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA 表达比较 与NC 组比较，MOD 组中脑TH 阳性神经元数量、Lamin B1 蛋白相对表达量均降低，IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA 相对表达量均升高（P均＜0.05）；与MOD 组比较，DHP100 组、DHP350 组中脑TH 阳性神经元数量、Lamin B1 蛋白相对表达量均升高，IL-1β 蛋白及MMP-3 mRNA相对表达量均降低，且DHP350 组IL-1β 蛋白及MMP-3 mRNA 相对表达量变化更明显，DHP350 组IL-6 蛋白及p16INK4amRNA 相对表达量均低于MOD组、DHP100 组（P均＜0.05）。见表2 及OSID 码图1、2。

表2 四组小鼠中脑TH阳性神经元数量和Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA表达比较（）

表2 四组小鼠中脑TH阳性神经元数量和Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA表达比较（）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与MOD组比较，#P＜0.05；与DHP100组比较，△P＜0.05。

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2.3 四组小鼠中脑黑质星形胶质细胞中Lamin B1表达比较 NC 组、MOD 组、DHP100 组、DHP350 组小鼠中脑黑质星形胶质细胞中Lamin B1 荧光表达量分别为10.44 ± 1.58、6.86 ± 0.38、8.09 ± 0.48、10.47 ± 1.17；MOD 组小鼠中脑黑质星形胶质细胞中Lamin B1 荧光表达量均低于NC 组、DHP100 组、DHP350组（P均＜0.05）。见OSID码图3。

2.4 加入三组细胞培养基的SH-SY5Y 细胞存活率比较 加入正常组、模型组、DHP 组细胞培养基的SH-SY5Y 细胞存活率分别为100.00% ± 8.48%、55.70% ± 5.73%、88.15% ± 6.55%，两两比较P均＜0.05。

2.5 三组细胞周期比例比较 与正常组比较，模型组G0/G1期细胞比例升高，S 期细胞比例降低（P均＜0.05）；与模型组比较，DHP 组G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例升高（P均＜0.05）。三组G2/M 期细胞比例比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、OSID码图4。

表3 三组细胞周期比例比较（%，）

表3 三组细胞周期比例比较（%，）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

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2.6 三组细胞β-gal 阳性率、端粒酶表达比较 与正常组比较，模型组β-gal 阳性率升高，端粒酶表达降低（P均＜0.05）；与模型组比较，DHP 组β-gal 阳性率降低，端粒酶表达升高（P均＜0.05）。见表4、OSID码图5。

表4 三组细胞β-gal阳性率、端粒酶表达比较（）

表4 三组细胞β-gal阳性率、端粒酶表达比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

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3 讨论

从中医角度出发，PD 属于虚损病症，又因其临床病机故归为“颤证”范畴，对其最早的认识可追溯到《黄帝内经》［12］。目前，我国PD 发病率仍呈上升趋势，全球范围内的发病率也随着年龄的增长而稳步升高［13-14］。PD 是一种慢性进行性疾病，其病程发展不可逆，一经诊断必须终生治疗［14］。传统的治疗策略通常是提高多巴胺（DA）水平、刺激DA 释放、抑制DA 降解，但是随着病情不断进展，PD 患者脑内DA 神经元不断丢失，在这一长期过程中，传统药物的治疗效果往往欠佳，并且会伴随一些难以避免的不良反应［15］。中医药已有数千年的发展历史，近年来也已经越来越被国际接受。虽然中医药治疗起效慢，但可长期应用，还可以减轻西药的不良反应与耐药性［16］。研究表明，中草药具有减缓PD进展的神经保护潜力，并且能够同时减轻其运动和非运动症状［17-18］。中医以辨证论治为核心，强调个体化治疗，不良反应较小，中西医结合治疗可以克服二者的局限，提高整体疗效，达到提高患者生活质量的目的。

细胞衰老是一种不可逆的生长停滞，因为具有抗增殖作用，通常被广泛认为是一种有效的肿瘤防御机制。短暂的细胞衰老可能于机体有益，但持续的细胞衰老代表着功能退化，会随着年龄和年龄相关疾病的病理发展而增加［18］。在PD模型中，星形胶质细胞中的阳性衰老标志物含量最高［19］。但目前检测细胞衰老没有统一的金标准，因此现在的学者大多采用多标记法综合考量细胞的衰老。衰老细胞本身存在细胞周期停滞，而衰老细胞中，细胞周期停滞又与细胞周期抑制物水平的增加有关，包括p16INK4a升高、Lamin B1 丢失，以及衰老相关分泌表型如IL-1β、IL-6、MMP-3表达增加，衰老相关的β-gal 阳性率升高［20］。IL-1β、IL-6同时还是炎症相关因子，与衰老标志物p16 都是PD 患者临床进展的重要预测因子［21］。本研究首先进行了小鼠的体内实验，结果显示与NC组比较，MOD组停留时间、悬挂时间均缩短，通过时间延长，且中脑TH阳性神经元数量、Lamin B1蛋白相对表达量均降低，IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA相对表达量均升高，提示PD小鼠出现运动障碍、神经元受损及细胞衰老，而使用不同浓度DHP干预后，小鼠上述改变得到缓解；这提示DHP干预可以减轻PD小鼠的运动障碍、神经元受损及细胞衰老。同时本研究将细胞衰老具体定位在星形胶质细胞，其后又以星形胶质细胞为研究对象进行了体外实验。

衰老细胞会对周围环境产生不可预估的影响，其最明显的特征就是细胞停止分裂，细胞周期停滞，且该过程不可逆。此外，衰老的分子机制还涉及端粒缩短。端粒长度的维持和延伸需要端粒酶，端粒酶逆转录酶是端粒酶的催化亚单位，其表达与端粒酶活性呈正相关关系［22］。研究表明，端粒酶表达升高能够改善PD 症状和α-Syn 积聚［23］。端粒缩短不会发生在表达端粒酶的细胞中，星形胶质细胞虽不表达端粒酶活性，但可以通过分裂缩短端粒导致衰老，以此影响神经退行性疾病的进展。本研究体外实验结果显示，与正常组相比，模型组细胞培养基会导致SH-SY5Y 细胞存活率降低，且模型组存在细胞周期停滞、β-gal 阳性率升高及端粒酶表达降低，而经过DHP 干预后的细胞上述改变得到缓解；这提示DHP可以减轻MPP+诱导的星形胶质细胞损伤、细胞周期阻滞及细胞衰老。

综上所述，DHP 可以减轻PD 小鼠的运动障碍，其机制可能与抑制星形胶质细胞衰老，从而减轻神经元损伤、发挥神经保护作用有关。