hsa_circ_0131457 在胰腺癌组织中的表达变化及其过表达对癌细胞生物学行为的影响

孔盼盼，董永良，刘慧芳，晏冬

1 新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科一病区，乌鲁木齐 830000；2 新疆医科大学附属肿瘤医院研究生科

胰腺癌恶性程度高，预后极差，总体5 年生存率仅9%左右，是消化系统最常见的恶性肿瘤之一［1］。胰腺癌发病隐匿，大部分患者早期缺乏特异性临床表现，就诊时已处于中晚期，导致手术切除率不足20%［2-3］。环状RNA（circRNA）是一类不具有5′末端帽子和3′末端polyA 尾巴，并以共价键形成环形结构的RNA 分子。circRNA 稳定性高，不易被降解，大量存在于唾液、外泌体及血液中，可作为肿瘤诊断和预后评估的生物标志物［3］。近年来研究证实，circRNA 异常表达参与了胰腺癌、食管鳞癌等多种恶性肿瘤的发生发展［4-6］。过表达hsa_circ_0000662、has_circ_0086375 可抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭，并诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长［7-8］。hsa_circ_0006988 在胰腺癌组织和血浆中的表达升高，且与临床分期、淋巴结浸润和远处转移有关，有可能成为胰腺癌预后评估的新型分子标志物［9］。研究发现，hsa_circ_0131457 定位于第6 号染色体，是SOX4 基因外显子编码的circRNA，对非小细胞肺癌的发生发展具有抑制作用［10］。然而hsa_circ_0131457 在胰腺癌中的作用及功能鲜见报道。2021年6月—2023年6月，本研究观察了hsa_circ_0131457在胰腺癌组织及细胞中的表达变化及其对胰腺癌细胞生物学行为的影响，为胰腺癌的临床诊治及预后评估提供潜在生物标志物。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 组织：选取2020年1月—12月新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科收治的胰腺癌患者7 例，术中收集其胰腺癌组织及配对癌旁正常组织各7 例份。纳入标准：①首次就诊，术前未行化疗或放疗等抗肿瘤治疗；②行胰腺手术，术后病理诊断为胰腺癌。排除标准：①影像学检查或术中发现有远处转移的晚期胰腺癌患者；②伴有其他恶性肿瘤或其他相关严重疾病。本研究通过医院伦理委员会审核（K-2020023），患者均签署知情同意书。细胞：胰腺癌细胞PANC-1、SW1990、CFPAC-1 及正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7 均购自苏州北纳创联生物技术有限公司。主要试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司，荧光定量PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems 公司，CCK-8 细胞增殖检测试剂盒均购自日本同仁公司，细胞凋亡、周期试剂盒均购自上海吉凯科技股份有限公司，凋亡相关蛋白细胞周期素D2（CCND2）和周期素依赖性激酶4（CDK4）重组蛋白检测试剂盒均购自上海钰博生物科技有限责任公司，hsa_circ_0131457 过表达载体pHBLV-ciR购自广州吉赛生物科技股份有限公司。

1.2 胰腺癌组织和细胞hsa_circ_0131457检测 采用实时荧光定量PCR 法。收集对数生长期的胰腺癌细胞PANC-1、SW1990、CFPAC-1 和正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7。采用TRIzol 法提取胰腺癌组织、癌旁正常组织及上述细胞中的总RNA，逆转录合成cDNA。PCR 反应体系10 µL：cDNA 样本1 µL，2 × SYBR Green Select Mix 5 µL，上、下游引物各0.7 µL，ROX 0.05 µL，使用RNase-free Water 补充至10 µL。引物序列：hsa_circ_0131457 上游引物5′-GCCCGACAUGCACAACGCCGAGA-3′，下游引物5′-GGAGCGGCUGCGC CUAAGCAUCA-3′。采用2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0131457相对表达量。

1.3 细胞分组及质粒转染

1.3.1 质粒的构建及验证 采用Fast pfu 扩增hsa_circ_0131457 过表达载体 pHBLV-ciR 的hsa_circ_0131457 序列，构建过表达质粒pHBLVcirc_0131457，将pHBLV- circ_0131457 采用慢病毒转染法转染到hsa_circ_0131457 表达最低的胰腺癌细胞中，48 h 后使用1 µg/mL 嘌呤霉素筛选稳转细胞。将过表达质粒通过脂质体转染法分别转入胰腺癌细胞中，通过GFP荧光检测转染效率合格。

1.3.2 细胞分组处理 取hsa_circ_0131457表达最低胰腺癌细胞进行后续实验，在细胞融合率80%左右且生长状态良好时，使用完全培养基制备成单细胞悬液，调整细胞密度为5 × 105/mL。将细胞接种至96孔板，分为过表达组和对照组，分别采用脂质体转染法转染“1.3.1”中构建的过表达质粒及对照质粒。

1.4 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。取两组转染后的细胞，37 ℃条件下进行细胞培养。分别于培养0、24、48、72、96 h，加入配置好的10% CCK-8溶液，置于培养箱中孵育1～4 h。使用酶标仪检测450 nm波长下的OD值，以此表示细胞增殖能力。

1.5 细胞凋亡能力观察 采用TUNEL 染色。取两组转染后的细胞，使用二甲苯脱蜡5～10 min，换用新鲜的二甲苯再次脱蜡5～10 min，无水乙醇作用5 min，90%乙醇作用2 min、70%乙醇作用2 min、蒸馏水作用2 min，20～37 ℃条件下滴加不含DNase 的蛋白酶K 20 µg/mL 作用15～30 min；使用PBS 或HBSS 洗涤3 次，在样品上滴加TUNEL 检测液50 µL，37 ℃避光孵育60 min。最后用抗荧光淬灭封片液封片，激发波长450～500 nm、发射波长515～565 nm，荧光显微镜下观察绿色荧光情况，以荧光信号的强度表示凋亡能力的强弱，计算细胞凋亡率。

1.6 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。用marker 笔在6 孔板背后作均匀的横线，每隔0.5～1 cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。取对数生长期的胰腺癌细胞，以5 × 105/孔接种于6 孔板，参照“1.3.2”进行分组处理，37 ℃条件下培养24 h。第二天在孔板上作一垂直于背后横线的划痕，PBS冲洗3 次，去除划下的细胞。加入无血清培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，于培养0、24 h进行拍照，测量划痕距离，其差值即为细胞迁移距离。

1.7 细胞侵袭能力观察 采用Transwell 小室实验。在Transwell 小室的下室（即24 孔板底部）加入含10% FBS 的培养基600～800 µL，上室加入两组转染后的细胞悬液100 µL（细胞密度为2 × 105/mL），孵箱培养24 h，用镊子小心取出chamber，PBS 冲洗2 次。移到预先加入4%甲醛的孔中，室温固定20 min，取出chamber，PBS 冲洗2 次。移到预先加入甲醇的孔中，室温透化20 min，取出chamber，PBS 冲洗2 次。移到预先加入Giemsa 染液的孔中，室温避光染色5 min，取出chamber，PBS 洗2 次。用湿棉棒擦去上室底部膜表面细胞，底面朝上晾干，移至载玻片，显微镜下对穿膜细胞进行计数。

1.8 细胞CCND2、CDK4 蛋白检测 采用Western blotting法。取两组转染后的细胞，加入含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解后用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中。将样品加入等量的2 × SDS上样缓冲液，100 ℃加热3～5 min，12 000 r/min 离心1 min。取上清行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在电泳槽中加入1 × 电泳缓冲液，连接电源。转膜完成后，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入CCND2、CDK4及内参GAPDH一抗、二抗，显影液避光显色和显影。使用化学发光成像仪显影成像，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁正常组织hsa_circ_0131457相对表达量比较 胰腺癌组织和癌旁正常组织hsa_circ_0131457 相对表达量分别为0.011 ±0.017、2.084 ± 2.287，二者比较P＜0.05。

2.2 胰腺癌细胞与正常胰腺导管上皮细胞hsa_circ_0131457 相对表达量比较 胰腺癌PANC-1、SW1990、CFPAC-1 细胞hsa_circ_ 0131457 相对表达量分别为0.123 ± 0.110、0.159 ± 0.082、0.141 ±0.129，均低于正常胰腺导管上皮细胞的1.174 ±0.839（P均＜0.05）。选取hsa_circ_0131457 表达最低的胰腺癌PANC-1 细胞用于后续细胞学研究。

2.3 两组不同时间点细胞增殖能力比较 见表1。

表1 两组不同时间点细胞增殖能力比较（）

表1 两组不同时间点细胞增殖能力比较（）

注：与对照组同时间点比较，*P＜0.05。

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2.4 两组细胞凋亡率、迁移距离及穿膜细胞数比较 见表2及OSID码图1。

表2 两组细胞凋亡率、细胞迁移距离及穿膜细胞数比较（）

表2 两组细胞凋亡率、细胞迁移距离及穿膜细胞数比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

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2.5 两组细胞CCND2、CDK4 蛋白相对表达量比较 见表3及OSID码图2。

表3 两组细胞CCND2、CDK4蛋白相对表达量比较（）

表3 两组细胞CCND2、CDK4蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

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3 讨论

胰腺癌是实体肿瘤中致死率最高的肿瘤之一，可通过神经、血管和淋巴等途径进行远处转移，极大地降低了患者的生存率，已成为全球肿瘤相关死亡的第三大主要原因［1］。目前有关胰腺癌侵袭、转移的具体机制尚不明确，探索其侵袭转移的机制对于寻找新的胰腺癌诊治靶点具有重要意义。已有研究表明，circRNA 与肿瘤、神经系统疾病、心血管系统疾病、糖尿病等多种疾病密切相关，在肿瘤的发生发展中可以起到抑制或促进两种不同的作用［11］。circRNA 结构稳定、表达丰度高且具有组织特异性、高度保守等特性，逐渐成为目前RNA 领域研究的最新热点［12］。

circRNA 主要通过以下机制发挥作用：①微小RNA（miRNA）的海绵作用。circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA 海绵的作用，进而解除miRNA 对其靶基因的抑制作用，升高靶基因表达，这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。②顺式调控亲本基因表达。大多数circRNA主要位于细胞质，circRNA 可能作为ceRNA，通过竞争miRNA 结合位点来调节其活性。③调节RNA 结合蛋白。RNA 结合蛋白在转录后过程中对RNA 的调控至关重要，参与了RNA 的成熟、运输、定位和翻译；RNA 聚合酶等RNA 结合蛋白可以与circRNA 结合，从而影响circRNA 的剪接、折叠、稳定、加工和定位。④蛋白翻译功能。circRNA 以往因为没有5′末端帽子和3′末端polyA 尾巴，被认为是不能被翻译的，研究显示仅有少部分的circRNA 具有蛋白翻译功能，其中与多聚体相关的circ-ZNF609可以被翻译成蛋白［13］。ZHANG 等［14］研究显示，circLARP4 可通过调节miR-424/LATS1/YAP信号通路，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。CHEN 等［15］研究发现，has_circ_0000190 在胃癌患者的血浆及组织中表达均下调，可以作为诊断胃癌的潜在生物标志物，且相对于癌胚抗原（CEA）和糖类抗原199（CA199）这两种经典的胃癌标记物，has_circ_0000190的诊断敏感度及特异度更高。HAN 等［16］研究发现，circMTO1 可以作为miR-9 的海绵体而抑制肝细胞癌的进展［17］。在胆囊癌中，circTCF25 过表达可以下调miR-103a-3p/miR-107，导致包括CDK6 在内的13 项靶基因上调，从而在体外和体内促进肿瘤细胞增殖、转移和侵袭［18］。然而目前尚缺乏关于circRNA 在胰腺癌中的研究报道。

本研究结果显示，胰腺癌组织hsa_circ_0131457表达降低，且胰腺癌PANC-1、SW1990、CFPAC-1 细胞hsa_circ_ 0131457相对表达量均低于正常胰腺导管上皮细胞，提示胰腺癌的发生发展可能与hsa_circ_0131457 低表达有关。为了探讨hsa_circ_0131457 对胰腺癌细胞生物学行为的影响，本研究以hsa_circ_0131457 表达降低最明显的胰腺癌PANC-1 细胞为研究对象，并进行hsa_circ_0131457过表达质粒转染；结果显示，过表达hsa_circ_0131457 后的胰腺癌细胞增殖能力、细胞迁移距离及穿膜细胞数均降低，细胞凋亡率及凋亡相关蛋白CCND2、CDK4 表达均升高。CCND2 编码的蛋白质属于高度保守的细胞周期蛋白家族，其成员在细胞周期内具有显著的蛋白质丰度周期性。CDK4 在细胞周期的G1期发挥重要作用，其与配体蛋白D 型结合形成复合物，能够磷酸化细胞周期蛋白抑制因子，从而促进细胞周期的进展。以上结果证实，hsa_circ_0131457 过表达对胰腺癌细胞的增殖、侵袭、转移具有抑制作用，是重要的抑癌因子。

综上所述，hsa_circ_0131457在胰腺癌组织和细胞中表达均降低，过表达hsa_circ_0131457 可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过上调CCND2、CDK4 表达促进细胞凋亡。本研究阐述了hsa_circ_0131457对胰腺癌进展的影响，为胰腺癌的治疗提供了新靶点。