刺槐素对小鼠骨髓巨噬细胞AIM2炎症小体活化的抑制作用

叶勒丹·马汉，王兆霞，吴选霞，补娟

新疆维吾尔自治区人民医院医学研究与转化中心，乌鲁木齐 830001

炎症小体是细胞内的一个关键多聚蛋白复合体，在免疫和炎症调控中发挥着重要作用。黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎症小体是由AIM2、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和pro-Caspase-1 组成的一种多聚蛋白复合物，其活化后可激活Caspase-1，促进白细胞介素（IL）-1β、IL-18 成熟与释放，从而引起炎症反应［1］。AIM2炎症小体在多种炎症疾病中扮演着重要角色，参与了动脉粥样硬化、皮肤病、肝病和神经炎症疾病等的发生发展，抑制AIM2炎症小体活化可能是治疗这些疾病的一种策略［2-3］。目前已经发现了一些对AIM2炎症小体有抑制作用的药物，包括RGFP966、穿心莲内脂、果糖—精氨酸等［4］，然而关于靶向AIM2炎症小体的抑制剂报道较少。刺槐素是一种天然的植物黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，参与糖尿病、哮喘、缺血性脑卒中等炎症相关疾病的治疗［5-6］。本课题组前期研究发现，刺槐素可以通过抑制Caspase-1 介导的IL-1β 表达，从而降低NLRP3、NLRC4炎症小体活化［7］。但是刺槐素对AIM2炎症小体活化的具体影响目前尚不清楚。2022年1月—2023 年1 月，本研究选用脂多糖（LPS）和一种双链DNA（dsDNA）模拟物poly（dA：dT）共同诱导小鼠骨髓巨噬细胞（BMDMs）中AIM2炎症小体的激活，观察刺槐素对AIM2炎症小体活化的影响，为研究炎症相关疾病的发病机制及治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：C57BL/6 小鼠10 只，体质量（20 ± 2）g，6～8 周龄，购自新疆医科大学，动物许可证号：SCXK（新）2018-0002，在室温20～25 ℃和相对湿度约55%的环境下适应性饲养一段时间。主要试剂：刺槐素、LPS 购自美国Sigma 公司，poly（dA：dT）购自美国InvivoGen 公司，Caspase-1 抗体、IL-1β抗体购自美国Abcam 公司，IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒购自杭州联科生物有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自南京建成科技有限公司。主要仪器：荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司，多功能酶标仪购自美国Bio-Rad公司，化学发光成像仪系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 BMDMs 的分离和培养 将小鼠颈椎脱臼处死，取出股骨后，从两端将其剪开，使用无菌注射器将细胞吹出。将细胞收集至无菌离心管中，1 500 r/min离心4 min，随后弃掉上清液。加入红细胞裂解液3～4 mL，将细胞重悬，静置4 min。加入无菌PBS并混匀，1 500 r/min离心4 min。将细胞悬液加入含有10 ng/mL 粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）的DMEM 培养基中，用无菌技术将其吹匀。将细胞悬液转移到培养瓶中，置于37 ℃细胞培养箱中进行培养。

1.3 细胞分组及LPS、poly（dA：dT）、刺槐素处理当BMDMs 融合至约80%时，分为对照组、LPS 组、LPS+poly（dA：dT）组和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组。对照组将BMDMs继续在完全培养基中培养3 h；LPS组将BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培养基中培养3 h；LPS+ poly（dA：dT）组将BMDMs在加入含50 ng/mL LPS 的完全培养基中培养3 h，再加入poly（dA：dT） 10 µmol/L 作用0.5 h；LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组将BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培养基中培养3 h，然后加入刺槐素10 µmol/L 作用0.5 h，最后加入poly（dA：dT） 10 µmol/L作用0.5 h。

1.4 细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白检测 采用Western blotting法。细胞裂解液总蛋白提取：收集三组细胞至离心管中，加入含蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液100 µL，充分混匀，4 ℃放置60 min；4 ℃条件下12 000 r/min 离心15 min，收集上清液。细胞上清液蛋白提取：收集三组细胞样本至离心管中，离心后取上清液转移至新的离心管中，加入相同体积的甲醇和1/4体积的氯仿涡旋混匀，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min；将上层液体去掉，再加入等体积甲醇，混匀后4 ℃条件下12 000 r/min 离心5 min，尽可能弃尽上清，55 ℃金属浴干燥5 min。使用BCA 法对上述收集的液体进行蛋白质定量，取30 µg 蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。转膜完成后，用5%脱脂奶粉封闭2 h。加入IL-1β、Caspase-1 和内参β-actin（稀释比例分别为1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 1 000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜；加入二抗（稀释比例为1∶ 5 000），摇床孵育1 h。使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBST）洗涤膜10 min，更换洗涤液，重复此步骤3 次。加入增强化学发光剂（ECL），进行避光显色和显影。采用Image J 软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.5 细胞上清液IL-1β、IL-18、TNF-α 蛋白检测采用ELISA法。各组分组处理24 h后收集细胞上清液，加入到ELISA 板的适当孔中，根据ELISA 试剂盒说明书操作。使用试剂盒提供的特异性抗体对IL-1β、IL-18、TNF-α进行捕获，将其固定在板上。加入适当的酶标记二抗，添加底物，观察颜色反应，并根据反应的光密度测定板上的吸光度。使用标准曲线确定IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平，计算每个样品的目标蛋白质浓度。

1.6 细胞毒性检测 采用LDH 法。取各组细胞上清液，按照LDH 试剂盒说明书操作，使用450 nm波长进行测定，参照公式（OSID 码图1）计算细胞上清液LDH浓度，以此表示细胞毒性。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验或Games-Howell检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量比较 各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与对照组、LPS 组比较，LPS+poly（dA：dT）组和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量均升高，且LPS+poly（dA：dT）组升高更明显（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较（）

表1 各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，#P＜0.05；与LPS+poly（dA：dT）组比较，△P＜0.05。

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2.2 各组细胞上清液IL-1β、IL-18 和TNF-α 蛋白表达比较 见表2。

表2 各组细胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表达比较（pg/mL，）

表2 各组细胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表达比较（pg/mL，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，#P＜0.05；与LPS+poly（dA：dT）组比较，△P＜0.05。

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2.3 各组细胞上清液LDH 水平比较 对照组、LPS 组、LPS+poly（dA：dT）组和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组细胞上清液LDH 水平分别为（223.189 ±13.283）、（913.839 ± 16.213）、（1 598.824 ±270.241）、（1 496.732 ± 75.670）U/L；与对照组比较，LPS 组、LPS+poly（dA：dT）组和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组细胞上清液LDH 水平均升高，且LPS+poly（dA：dT）组和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组升高更明显（P均＜0.05）。

3 讨论

炎症小体是先天性免疫系统的一部分，负责感知受损细胞中来自病原体的危险信号，这对于保护宿主免受环境威胁至关重要。AIM2 是一种能识别细胞质内DNA 的传感器蛋白，由N 端PYD 域和C 端HIN 域组成，当dsDNA 与HIN 结合时，可通过PYD结合ASC募集pro-Caspase-1形成AIM2炎症小体，产生活化后的Caspase-1 可导致炎症因子IL-1β、IL-18的成熟与释放，二者是炎症反应的关键调控因子，参与引起炎症反应［8］。此外，活化后的Caspase-1 还可通过裂解焦孔素D（GSDMD），直接介导细胞焦亡［9］。因此，Caspase-1 和IL-1β 通常是AIM2 炎症小体活化的直接标志。

近年来，AIM2炎症小体在疾病调控中的作用备受关注，而寻找能够抑制AIM2 炎症小体的药物具有重要的临床治疗意义。目前，许多抑制AIM2 炎症小体的药物主要通过研究与AIM2 相关的疾病进行探索，如RGFP966 抑制剂可通过下调AIM2 炎症小体表达来减轻缺血性脑损伤［10］；穿心莲内酯通过抑制AIM2 炎症小体激活和细胞焦亡，从而改善放射性肺损伤［11］；槲皮素通过下调AIM2 表达而抑制JAK2/STAT1 通路，从而减轻炎症性皮肤病引发的炎症反应［12］。在感染DNA 病毒或转染DNA 类似物的情况下，细胞质中的dsDNA 能够被AIM2 直接识别［4］。DNA 病毒（小鼠巨细胞病毒、痘苗病毒、人乳头瘤病毒等）或某些细菌（科斯特菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等）均能激活AIM2 炎症小体［13］。刺槐素作为一种天然化合物，已有研究证明其具有抗炎和抗氧化等多种生物活性［5，14］，但是其对AIM2 炎症小体的影响鲜见报道。

研究显示，LPS 预刺激巨噬细胞并转染poly（dA：dT）可特异性活化AIM2 炎症小体，是一种用于筛选靶向AIM2 炎症小体抑制剂的经典方法［15-16］。在炎症小体激活途径中，炎症小体成分的转录上调和pro-Caspase-1 的激活被认为是导致pro-IL-1β 成熟的上游信号。为了研究刺槐素对AIM2 炎症小体活化的影响，本研究检测了细胞裂解液中的pro-Caspase-1、pro-IL-1β 表达变化，以及上清液中成熟的Caspase-1 和IL-1β 表达变化。结果显示，与对照组、LPS组比较，LPS+poly（dA：dT）组上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量均升高，这表明LPS 和poly（dA：dT）共同刺激可以激活小鼠BMDMs 的AIM2 炎症小体，导致Caspase-1 和IL-1β释放，从而引发炎症反应，与已有的研究结果一致［17-18］。本研究结果显示，各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义，与LPS+poly（dA：dT）组比较，LPS+poly（dA：dT）+刺槐素组上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量均降低，说明刺槐素对AIM2炎症小体的抑制作用并非通过改变炎症小体成分转录水平，而是通过抑制Caspase-1 的活化来实现的，该结果与既往研究结果类似［19］。

此外，本研究进一步通过ELISA法检测上清液中炎症因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，结果显示poly（dA：dT）诱导后BMDMs中这三种炎症因子表达均升高，经刺槐素处理后只有IL-1β 表达降低，IL-18 和TNF-α 表达无明显改变。炎症因子IL-1β、IL-18 和TNF-α的生成不仅可以由AIM2炎症小体激活，还存在其他生成途径，这表明刺槐素可能并非通过AIM2途径调控IL-18和TNF-α的表达。细胞毒性的检测是为了解不同处理条件对细胞的影响，LDH是一种存在于细胞质中的酶，只有当细胞膜受损时LDH才会被释放至细胞外。本研究结果显示，poly（dA：dT）诱导后BMDMs上清液LDH浓度升高，经刺槐素处理后LDH无明显变化。前期本课题组发现，刺槐素可抑制NLRP3 炎症小体活化后LDH 的释放，但本研究显示刺槐素对AIM2炎症小体活化后LDH的释放没有显著影响，具体原因还需要深入研究。

综上所述，刺槐素对LPS 与poly（dA：dT）共诱导小鼠BMDMs 的AIM2 炎症小体活化具有抑制作用，能够减少细胞中Caspase-1、IL-1β 蛋白表达，从而减轻细胞炎症反应。这些发现为刺槐素作为潜在的炎症抑制剂提供了有力支持，为其在AIM2 炎症小体相关疾病治疗中的应用奠定了基础。但是，刺槐素如何抑制AIM2 炎症小体的活化及其具体的作用机制仍需进一步研究，这将成为我们未来研究的重点。