不同复温时点的热打击人骨骼肌细胞损伤情况观察及其机制

刘斌，袁芳芳，豆春丽，肖宝，李霖，李慧，苏磊

1 中南大学湘雅医学院附属长沙医院 长沙市第一医院急诊科，长沙 410005；2 南部战区总医院重症医学科；3 中南大学湘雅三医院血液科

中暑是一种严重威胁军民生命的急危重病，尤其是重症中暑，常合并多器官功能衰竭综合征［1-3］。横纹肌溶解症（RM）是重症中暑的常见并发症，目前多采用热打击人骨骼肌细胞（HSKMC）的方法模拟RM［4］。瞬时感受器电位香草酸受体亚型（TRPV）通道是TRP 通道家族的一个亚型，又被称为辣椒素受体，是目前研究最多的TRP 通道蛋白。TRPV 包括6 个亚型，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4 均有明显的热敏感性，被称作温度敏感通道，对Ca2+具有通透性，其活化后介导Ca2+内流［5-6］。本课题组前期研究发现，热打击可诱导HSKMC 细胞质游离Ca2+浓度升高、线粒体损伤及炎症因子释放增加，从而造成细胞损伤，但是复温后的热打击细胞是否恢复还是损伤加重尚不清楚［7］。2019年3月—2020年5月，本研究观察了不同复温时点的热打击HSKMC 损伤情况，并探讨其机制是否与TRPV4 及其介导的Ca2+内流有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：HSKMC 购自美国Santa 公司，用高糖DMEM 培养液（含10%胎牛血清、10 万U/L 青霉素、100 mg/L链霉素），于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。主要试剂：CCK-8 检测试剂盒、ECL 发光液、钙离子荧光探针均购自上海碧云天生物技术有限公司，TRPV4 激动剂GSK1016790A（GSK）、TRPV4 抑制剂HC-067047（HC）均购自美国MCE 公司，TRPV4 抗体购自美国Abcam 公司，逆转录试剂盒、转录试剂盒均购自日本TaKaRa 公司。仪器：细胞培养箱购自美国Thermo Fisher 公司，透射电子显微镜购自日本日立新公司，全自动酶标仪购自美国Biorad 公司，流式细胞仪购自美国BD 公司，荧光定量PCR仪购自美国凯杰公司。

1.2 热打击细胞模型建立及复温处理 将对数生长期的HSKMC 分为热打击组和对照组。热打击组于43 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养2 h，建立热打击细胞模型，然后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中复温，复温时间分别为0、6、12、24 h。对照组置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.3 细胞活力检测 采用CCK-8 法。将细胞以5 × 104/孔接种于96 孔板中，待贴壁稳定后参照“1.2”进行分组处理。按照CCK-8 试剂盒说明书操作，每孔加入CCK-8溶液10 µL，将培养板置于37 ℃孵箱内孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm 处的光密度（OD）值，计算细胞存活率。

1.4 细胞超微结构观察 取分组处理后的两组细胞，2.5%戊二醛固定液固定，4 ℃孵育过夜，透射电镜下观察细胞超微结构。

1.5 细胞TRPV4 蛋白检测 采用Western blotting法。取分组处理后的两组细胞，使用含有蛋白酶抑制剂的磷酸酶裂解液进行裂解，提取总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒定量检测蛋白总浓度。行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将蛋白转移至PVDF 膜上，5% BSA 室温封闭1 h。洗膜后加入TRPV4 及内参GAPDH 一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗3 次，5 min/次；加入二抗（稀释比例均为1∶10 000），室温孵育1 h，TBST 洗3 次，5 min/次。使用ECL 发光液显色、曝光，计算TRPV4蛋白相对表达量。

1.6 细胞TRPV4 mRNA 检测 采用实时荧光定量PCR 法。取分组处理后的两组细胞，使用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，超显微分光光度计根据OD260/280测定RNA 浓度和纯度，转录试剂盒将总RNA 逆转录生成cDNA，上PCR 仪进行检测。TRPV4 引物序列：上游引物5'-ATCGTCTCAGCAGCCCTCTA-3'、下游引物5'-TCGGAAAAGGTCCTTGAAGA-3'、引物长度168 bp；内参GAPDH 引物序列：上游引物为5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'、下游引物为5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'、引物长度201 bp。采用2-ΔΔCt法计算TRPV4 mRNA相对表达量。

1.7 TRPV4 对Ca2+内流的影响观察 采用流式细胞术。将对数生长期的HSKMC分为四组，即HS组、GSK+HS 组、HC+HS 组和NC 组。HS 组、GSK+HS组、HC+HS组均参照1.2建立热打击细胞模型，复温时间均为12 h，GSK+HS 组、HC+HS 组在热打击前0.5 h 分别给予GSK 500 nmol、HC 5 µmol；NC 组仅在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。去除各组细胞培养液，PBS 冲洗3 次。按照钙离子荧光探针说明书加入Fluo-4 AM 工作液（2 µmol），37 ℃孵育60 min进行荧光探针装载。PBS 冲洗3 次，上流式细胞仪检测Fluo-4 荧光强度，以此表示细胞内Ca2+浓度，激发波长为488 nm、发射波长为520 nm。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞存活率比较 复温0、6、12、24 h的热打击组与对照组细胞存活率分别为80.81% ±6.14%、73.19% ± 6.09%、61.41% ± 7.9%、40.33% ±2.08%、100.00%；与对照组比较，复温0、6、12、24 h的热打击组细胞存活率均降低（P均＜0.05）；随着复温时间的延长，热打击组细胞存活率依次降低，两两比较P均＜0.05。

2.2 两组细胞超微结构比较 与对照组比较，复温0、6 h的热打击组细胞即可出现超微结构改变，主要表现为细胞肿胀、体积变大，细胞质空泡化，线粒体肿胀、脱颗粒、双嵴消失，细胞核周间隙增宽，细胞核凝聚、固缩，部分包膜连续性中断；复温12、24 h的热打击组细胞出现核仁溶解消失，细胞核碎裂、染色质边集，细胞质结构崩解、呈颗粒状。见OSID码图1。

2.3 两组细胞TRPV4 mRNA 及蛋白相对表达量比较 与对照组比较，复温0、6、12、24 h的热打击组细胞TRPV4 mRNA 及蛋白相对表达量均升高（P均＜0.05）。复温0、6、12 h 的热打击组细胞TRPV4 蛋白相对表达量依次升高（P均＜0.05），复温12、24 h的热打击组细胞TRPV4 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。复温0、6、12、24 h的热打击组细胞TRPV4 mRNA 依次升高，两两比较P均＜0.05。见表1及OSID码图2。

表1 两组细胞TRPV4 mRNA及蛋白相对表达量比较（）

表1 两组细胞TRPV4 mRNA及蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

?

2.4 四组细胞内Ca2+浓度比较 NC 组、HC+HS 组、HS 组、GSK+HS 组细胞内Ca2+浓度分别为2.72 ±0.54、6.06 ± 0.70、11.94 ± 1.35、31.61 ± 1.73，组间两两比较P均＜0.05。

3 讨论

中暑是在剧烈的体力活动或暴露在热环境后发生的极端高温（核心体温 ＞ 40.5 ℃）。根据病因和易感人群，中暑可分为经典型中暑和劳累型中暑［1］。RM 是劳累型中暑的常见并发症，防治RM 是改善重症中暑患者多器官功能衰竭综合征及预后的关键措施［8，10-12］。RM 发生时肌细胞被破坏，释放细胞内毒素、自由基及炎症介质等物质入血，进一步引起凝血功能紊乱、血管内皮损伤、酸碱失衡等，从而造成多器官功能衰竭，增加患者病死率。以往研究报道，RM 并发其他脏器功能损伤的发生率为51.0%，病死率高达32.0%［8］。急性肾功能衰竭和弥漫性血管内凝血是RM 晚期最严重的并发症，15%～33%的RM 患者可能发生急性肾功能衰竭［8-9］。此外，约25%的RM 患者还可能合并肝功能异常。因此，针对RM 进行相关研究对于降低重症中暑患者病死率具有重要意义。本研究结果显示，复温0、6、12、24 h的热打击组细胞存活率均低于对照组，且随着复温时间的延长，热打击组细胞存活率依次降低；超微结构观察结果显示，复温0、6 h的热打击组细胞即可出现超微结构改变，而复温12、24 h的热打击组细胞甚至出现核仁溶解消失，细胞核碎裂、染色质边集，细胞质结构崩解、呈颗粒状；这提示热打击会降低HSKMC 存活率，且会造成细胞结构破坏，复温时间越长，上述变化越明显。

目前，RM 引发肌细胞损伤的具体机制尚未明确，可能与下列因素有关：①三磷酸腺苷（ATP）耗竭：位于质膜（肌膜）上的离子通道（包括Na+/K+泵和Na+/Ca2+交换器）在正常情况下维持细胞内低Na+和Ca2+浓度，而在肌纤维内保持高K+浓度；肌肉去极化导致Ca2+从肌质网流入细胞质，引起肌肉细胞发生肌动蛋白—肌球蛋白交联收缩，所有这些过程都依赖于ATP 提供能量。RM 发生时伴随ATP 能量耗竭，肌酸磷酸水平下降，糖元储存减少等代谢紊乱；当ATP 能量降低或ATP 消耗发生时，会导致细胞内电解质平衡的破坏，结果是细胞内过多的Na+和Ca2+流入，细胞内Na+增加会将水吸入细胞内，破坏细胞内空间的完整性；而细胞内Ca2+增加会导致持续的肌原纤维收缩，进一步耗尽ATP。②细胞内钙超载：肌肉缺血损伤导致各种病理性变化，使Ca2+内流增多，细胞内钙超载继发细胞功能失调，磷酸化酶、蛋白酶、核酸酶被激活，细胞膜被降解，细胞呼吸被抑制，造成ATP 生成减少。酶的激活伴随大量能量需求，从而加剧缺血细胞已经存在的能量危机，最终导致细胞死亡。但不管其机制如何，往往都是通过级联效应，使细胞外的Ca2+进入到细胞内，从而导致钙超载，细胞内钙依赖性蛋白酶及磷脂酶被激活，肌动蛋白与肌球蛋白产生病理性交互作用，导致肌原纤维、细胞骨架及细胞膜蛋白破坏，引起肌肉破坏、肌纤维坏死及细胞内容物释放到细胞外和血液中。各种损伤最终结合在一个共同的效应通路上，从而启动RM的级联反应［14］。

TRPV4 是一种非选择性的Ca2+通道蛋白，能被机械刺激、热和内源性花生四烯酸代谢物（环氧二十三烷酸）在内的多种物理化学刺激以及炎症刺激激活［14-15］。目前研究显示，TRPV4 在肠上皮细胞、肠巨噬细胞和肠神经元等细胞中高表达［16-17］。TRPV4 激活可引起肠胶质细胞外Ca2+内流，并促进ATP 释放与炎症因子表达［18］。本研究结果显示，与对照组比较，复温0、6、12、24 h 的热打击组细胞TRPV4 mRNA 及蛋白相对表达量均升高，且随着复温时间的延长，其升高更明显；这提示热打击造成HSKMC损伤的机制与激活TRPV4 有关。本研究结果显示，NC组、HC+HS组、HS组、GSK+HS组细胞内Ca2+浓度依次升高，提示TRPV4特异性抑制剂HC可降低Ca2+内流，TRPV4特异性激动剂GSK则促进Ca2+内流。

综上所述，热打击会造成HSKMC 存活率降低及结构损伤，热打击后复温时间越长对细胞的损伤越大，其机制可能与促进TRPV4 表达及其介导的Ca2+内流有关，为寻找预防与治疗RM 提供了新的干预靶点。但是本研究仅初步探讨了TRPV4 参与RM的可能机制，仍需进一步体内实验进行验证并深入探讨其相关调控机制。