美洲大蠊小肽预处理对H2O2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激及凋亡的抑制作用

孙蕊仙，唐运萍，杨礼莲，伏蓉，王婧羽，隋世燕

1 大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；2 大理大学公共卫生学院

氧化应激是由体内氧化与抗氧化作用失衡引发的，也是导致衰老和疾病发生的一个重要因素。研究认为，氧化应激会导致女性内分泌功能失调、卵母细胞数量减少，引起卵巢储备功能下降［1］。氧化应激在女性不孕症的发生中起着关键作用，尤其是与年龄相关的生育能力下降有关［2］。因此，建立人卵巢颗粒细胞的氧化损伤模型对于研究卵巢老化及生殖功能减退相关疾病的发病机制，以及筛选新型抗氧化剂具有重要意义。美洲大蠊原产于南美洲，属于蜚蠊类，俗称“蟑螂”。美洲大蠊小肽是从美洲大蠊虫体中提取并经分离纯化后得到的，是一种以小分子肽类为主（占94.44%）的精提物［3］。邹俊波等［4］研究发现，美洲大蠊小肽可通过降低氧自由基及一氧化氮自由基的含量预防急性胃溃疡的发生，说明其具有抗氧化作用。本课题组前期研究也发现，美洲大蠊小肽具有抑制H2O2诱导细胞氧化应激损伤及凋亡的作用［5］，但对其是否有预防作用尚不清楚。2023年3月—7月，本研究对H2O2诱导的人卵巢颗粒细胞（KGN细胞）氧化应激模型给予不同浓度美洲大蠊小肽预处理，观察其对细胞氧化应激和凋亡的抑制作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂 细胞：KGN 细胞由南京农业大学农业部动物生理与生化重点实验室赠予。药物：美洲大蠊小肽由大理大学美洲大蠊研究团队提供。主要试剂：3% H2O2购自美国Sigma公司，CCK-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司，活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞活力检测的最佳实验条件确定

1.2.1 CCK-8 溶液配置所需的胎牛血清比例确定 取对数生长期的KGN细胞，加入不同浓度（0、150、200、250 µmol/L）H2O2作用2、4、6 h时，分别采用添加15%胎牛血清的培养液、无血清培养液配制CCK-8溶液，采用CCK-8法检测细胞存活率。结果显示，当使用添加15%胎牛血清的培养液配制CCK-8溶液时，0、150、200、250 µmol/L H2O2作用KGN 细胞2、4、6 h 时的细胞存活率无明显下降趋势反而升高，见表1；当使用无血清培养液配制CCK-8溶液时，与0 µmol/L H2O2作用KGN 细胞相同时间比较，150、200、250 µmol/L H2O2作用KGN细胞2、4、6 h时的细胞存活率均降低，且250 µmol/L H2O2作用6 h后的KGN细胞存活率降低最明显（P均＜0.05），见表2。提示15%胎牛血清会对CCK-8溶液检测细胞存活率的结果造成影响，后续使用无血清培养基配制CCK-8溶液，同时选择浓度为250 µmol/L的H2O2作用6 h进行实验。

表1 添加15%胎牛血清培养液配制CCK-8溶液检测得到不同浓度H2O2作用后的细胞存活率比较（）

表1 添加15%胎牛血清培养液配制CCK-8溶液检测得到不同浓度H2O2作用后的细胞存活率比较（）

注：与0 µmol/L H2O2作用相同时间点比较，*P＜0.05；与同浓度H2O2上一时间点比较，#P＜0.05。

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表2 无血清培养液配制CCK-8溶液检测得到的不同浓度H2O2作用后的细胞存活率比较（）

表2 无血清培养液配制CCK-8溶液检测得到的不同浓度H2O2作用后的细胞存活率比较（）

注：与0 µmol/L H2O2作用相同时间点比较，*P＜0.05；与150 µmol/L H2O2作用相同时间点比较，#P＜0.05；与200 µmol/L H2O2作用相同时间点比较，△P＜0.05；与同浓度H2O2上一时间点比较，▲P＜0.05。

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1.2.2 细胞接种密度确定 将对数生长期的KGN细胞分为两部分，细胞接种密度分别为0.7 × 104、1 × 104/孔，每一部分分别加入0、250 µmol/L H2O2作用6 h，使用无血清培养液配制CCK-8 溶液，采用CCK-8 法检测细胞存活率。结果显示，接种密度为0.7 × 104/孔的KGN 细胞经0、250 µmol/L H2O2作用6 h 后的细胞存活率分别为100.00% ± 4.50%、62.46% ± 1.98%，接种密度为1 × 104/孔的KGN 细胞经0、250 µmol/L H2O2作用6 h 后的细胞存活率分别为100.00% ± 4.50%、83.86% ± 4.56%，两部分加入H2O2后细胞存活率均下降（P均＜0.05），但细胞密度为0.7 × 104/孔较1 × 104/孔的细胞存活率下降更为明显（P＜0.05）；提示细胞接种密度为1 × 104个/孔时，CCK-8 法对OD 值的变化不敏感。后续选择KGN细胞的接种密度为0.7 × 104/孔进行实验。

1.3 细胞分组及美洲大蠊小肽预处理 取对数生长期的KGN 细胞，分为空白组、H2O2组和美洲大蠊小肽50、100、150 组。五组均使用添加15%胎牛血清和100 IU/mL 青—链霉素的DMEM-F12 培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养24 h；H2O2组加入250 µmol/L H2O2作用6 h；美洲大蠊小肽50、100、150 组分别加入50、100、150 µg/mL 美洲大蠊小肽进行预处理，然后加入250 µmol/L H2O2作用6 h。

1.4 细胞活力观察 采用CCK-8 法。取对数生长期的KGN细胞，以0.7 × 104/孔接种于96孔板，每组设置6 个平行孔。细胞融合度为85%～90%时，参照“1.3”进行分组处理，美洲大蠊小肽50、100、150组分别预处理6、12、24 h。各组分组处理后同一时间弃培养液，PBS 洗一遍，根据试剂盒说明书，每孔加入无血清培养基配比的CCK-8溶液100 µL（CCK-8∶培养液 = 1∶9），在37 ℃、5%CO2培养箱内孵育1 h，计算细胞存活率。

1.5 细胞NO、MDA 和ROS 表达检测 取对数生长期的KCN 细胞，以5 × 105/孔接种于12孔板，每组设置6 个平行孔；参照“1.3”进行分组处理，美洲大蠊小肽50、100、150 组分别预处理12 h；加入裂解液裂解细胞后，使用多功能荧光酶标仪测定细胞NO、MDA表达。取对数生长期的KCN细胞，以5 × 104/孔接种于12 孔板，每组设置3 个平行孔；参照“1.3”进行分组处理，美洲大蠊小肽50、100、150 组分别预处理12 h；每孔加入DCFH-DA（DCFH-DA∶无血清培养基 = 1∶1 000）500 µL，37 ℃孵育30 min，无血清培养基洗涤3 次后，使用倒置荧光显微镜观察细胞荧光强度，以此表示ROS表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验方法，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点细胞存活率比较 见表3。

表3 各组不同时间点细胞存活率比较（）

表3 各组不同时间点细胞存活率比较（）

注：与空白组同时间点比较，*P＜0.05；与H2O2组同时间点比较，#P＜0.05；与同组预处理6 h比较，△P＜0.05。

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2.2 各组细胞NO、MDA 及ROS 表达比较 见表4及OSID码图1。

表4 各组细胞NO、MDA、ROS表达比较（）

表4 各组细胞NO、MDA、ROS表达比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与H2O2组比较，#P＜0.05。

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3 讨论

氧化应激参与了多种卵巢生理功能的调节，是导致卵巢细胞凋亡及卵巢功能衰退的主要原因之一。因此，减轻卵巢氧化应激和炎症对维持卵巢功能非常重要。H2O2极易透过细胞膜导致细胞结构的氧化损伤或诱发细胞凋亡。研究表明，利用H2O2诱导体外培养的细胞发生氧化损伤并引起细胞凋亡是一种建立细胞氧化应激的有效方法［6］。H2O2可通过引起氧化应激使细胞内ROS 生成增多，导致细胞凋亡［7-8］。研究认为，低剂量的H2O2可通过调节线粒体功能而发挥抗炎作用，但随着H2O2浓度的升高，其破坏作用增强，导致细胞发生凋亡甚至死亡［9］。因此，确定H2O2的最佳作用浓度及时间对于建立可靠的氧化损伤细胞模型具有重要意义，才可以在该细胞模型上研究卵巢早衰的发病机制以及筛选新型抗氧化剂。研究显示，50% ～ 80%的细胞存活率均可以促使H2O2造模成功［13-14］。本研究采用CCK-8 法检测细胞存活率的结果显示，当使用添加15%胎牛血清的培养液配制CCK-8 溶液时，不同浓度H2O2作用KGN 细胞后的细胞存活率无明显下降趋势反而升高，这提示胎牛血清会对CCK-8 溶液的细胞活力检测结果造成影响，后续需使用无血清培养基配制CCK-8 溶液；而当使用无血清培养液配制CCK-8 溶液时，150、200、250 µmol/L H2O2作用KGN细胞2、4、6 h 时的细胞存活率均降低，且250 µmol/L H2O2作用6 h 后的KGN 细胞存活率降低最明显，这提示H2O2的最佳作用条件为250 µmol/L作用6 h。

研究发现，细胞接种密度不合适会影响细胞增殖及毒性实验的结果，适宜的细胞接种密度可以促进细胞间接触的形成，从而维持合适的细胞表型［10］。管莹等［11］研究发现，细胞生长达到饱和密度后，细胞间会发生接触抑制，导致细胞增殖减慢、生长停止，从而进入平台期，出现假阳性结果。刘飞祥等［12］研究发现，细胞密度过高或过低时，CCK-8法对细胞数量翻倍时的OD值变化不敏感，响应量变化较小。本研究发现，当细胞接种密度为1 × 104/孔时，可能由于细胞密度太大，提前进入平台期而出现假阳性结果，或者因细胞密度过高时CCK-8法对OD值的变化不敏感，响应量变化较小，导致实验结果不准确，而接种密度为0.7 × 104/孔时就没有这种情况。因此，我们在进行CCK-8检测时需将细胞接种密度控制为0.7 × 104/孔。

H2O2是一种稳定性相对较好，能够跨膜运转的ROS分子。细胞存活率和细胞内ROS水平是评估氧化应激细胞模型是否建立成功的关键指标，最佳的造模条件既要极大程度减轻细胞损伤又要使ROS水平显著升高。当机体抗氧化防御系统能力减弱或遭受炎症等因素刺激时，ROS含量或活性增强，破坏氧化与抗氧化防御系统之间的平衡，导致氧化应激的发生，从而促进Caspase-3表达，激活线粒体凋亡通路，造成氧化应激和组织损伤［15］。MDA作为体内脂质过氧化物的最终代谢产物，是评价机体氧化应激损伤的重要指标之一。有研究发现，ROS水平过高会引起细胞内氧化应激，进而降低女性的生殖寿命［16］。李艳青等［17］研究发现，多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠血清及卵巢组织中MDA表达均升高，Caspase-3、Bax蛋白表达升高。周绵莉等［18］研究二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠氧化应激及细胞凋亡的影响时发现，小鼠血清ROS、MDA表达水平升高，Caspase-3、Bax及细胞凋亡上调。本研究结果显示，H2O2组细胞NO、MDA、ROS表达均高于空白组，细胞存活率低于空白组，提示氧化应激细胞模型建立成功。

美洲大蠊提取物是用不同溶剂溶解美洲大蠊虫体内相应化学成分后，经提取分离得到的纯化物或混合物，具有抗氧化、抗心衰、抗肝纤维化等广泛的药理作用［19］。研究发现，美洲大蠊提取物可以抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，从而减轻炎症反应［20］。邹俊波等［4］研究显示，美洲大蠊醇提物对大鼠机体和卵巢具有一定的抗氧化应激功能。孔彩华［21］研究显示，美洲大蠊小肽能够抑制H2O2诱导的猪卵巢颗粒细胞氧化应激和细胞凋亡。本研究结果显示，预处理6 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率与H2O2组比较差异均无统计学意义，预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率均高于H2O2组及同组预处理6 h；同时，预处理12 h 的美洲大蠊小肽50、100、150 组细胞MDA、NO、ROS表达均低于H2O2组，且美洲大蠊小肽50、100、150组间比较差异均无统计学意义；这提示美洲大蠊小肽对H2O2诱导的KGN细胞氧化应激有很好的预防作用，同时结合成本和实际情况，提示美洲大蠊小肽的最佳作用条件为50 µg/mL作用12 h。

综上所述，美洲大蠊小肽能够预防H2O2诱导的KGN 细胞氧化应激及细胞凋亡，以50 µg/mL 作用12 h为最佳作用条件。本实验不仅摸索出CCK-8法检测KGN 细胞活力的最佳实验条件，同时也发现了美洲大蠊小肽预防H2O2诱导KGN 细胞氧化应激及凋亡的最佳作用条件，为后续探索美洲大蠊小肽的作用机理提供数据支持。