一株鸭源大肠杆菌噬菌体vB_EcoS214 的分离鉴定

刘 娜 陈红梅 江南松 黄 瑜 傅光华 程龙飞

（福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室，福州 350013）

禽致病性大肠杆菌是侵害水禽的常见的一种致病菌，其致病类型多种多样，导致鸭体消瘦、死亡、胴体淘汰等造成巨大的经济损失， 严重制约了养禽业的持续健康发展。 抗生素对于禽致病性大肠杆菌感染的治疗起到重要的作用，然而在治疗过程中，该菌容易产生耐药问题，在国家限抗、减抗的大背景下，抗生素治疗的局限性越来越明显。 相对于抗生素治疗，噬菌体治疗法具有乐观的应用前景，它的特异性强、无明显副作用等都具有很大的优势[1]。 本项目从鸭场污水中分离到能裂解鸭源大肠杆菌的噬菌体，以期为水禽致病性大肠杆菌病的噬菌体疗法提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及配制 麦康凯琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；LB 肉汤、琼脂、氯化钠、明胶、硫酸镁等，生工生物工程（上海）股份有限公司产品；SM 缓冲液：取氯化钠5.8 g、硫酸镁2 g、明胶0.1 g，加入1 000 mL 双蒸水中， 高压灭菌后室温保存；0.7%半固体LB 琼脂、LB 肉汤和麦康凯琼脂平板按常规方法制备。

1.2 菌株及培养条件 鸭源大肠杆菌21 株， 保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。取冻干粉，划线培养于麦康凯平板，37 ℃温箱中培养16 h， 挑单菌落接种于LB 肉汤，37 ℃振荡培养4 h，4 ℃保存。

1.3 样品的采集与处理 取福建省福州市永泰某成年麻鸭场污水样品500 mL，8 000×g 离心10 min，上清用450 nm 滤膜过滤。 滤液中加入等体积的2×LB，然后加入大肠杆菌菌液，37 ℃温箱中放置10 h。8 000×g 离心10 min，用450 nm 滤器过滤上清。 重复增殖1 次滤液， 滤液经2 次增殖后放置4 ℃保存备用。

1.4 噬菌体分离和纯化 取一定量的大肠杆菌菌液与噬菌体原液混匀，37 ℃水浴15 min 后加45 ℃的LB 肉汤（6 g/L），混匀后立即倒入麦康凯平板上，待平板彻底凝固后再将它倒置在37 ℃温箱中培养6 h 左右，观察是否出现透明空斑（噬菌斑）。 按文献方法[2]，挑取单个透亮且清晰的噬菌斑，加入1 mL SM 缓冲液中，吸取上清用450 nm 滤器过滤，得到噬菌体原液。 适当稀释噬菌体原液后再与大肠杆菌菌液混匀铺板。 重复上述步骤3～5 次，直到平板上出现的噬菌斑大小均匀、形态一致为止。

1.5 噬菌体vB_EcoS214 的电镜观察 取纯化后的噬菌体vB_EcoS214 培养液10 μL 滴加在载膜铜网上，静置1 min 左右，用滤纸将液体吸干，再加入磷钨酸（pH 6.8，20 g/L）负染1 min，用滤纸吸干，待自然干燥后，使用日立透射电镜HT7700 观察。

1.6 噬菌体vB_EcoS214 的裂解谱测定 将21 株大肠杆菌加入适量的噬菌体， 再与半固体LB 琼脂混合均匀后立即倒入麦康凯琼脂，待完全凝固后，置37 ℃培养6～12 h，观察是否形成噬菌斑。

2 结 果

2.1 噬菌体的分离及纯化 以Ef-13 为宿主菌时，可以观察到透亮的噬菌斑。挑单个噬菌斑，连续传代5 次后，获得纯化的噬菌体，命名为vB_EcoS214。 噬菌斑的形态和大小保持均匀一致，呈圆形、透明，边缘清晰，直径约为1 mm，见图1。

图1 噬菌体vB_EcoS214 的噬菌斑

2.2 噬菌体vB_EcoS214 的形态 噬菌体vB_EcoS214 由1 个多面体的头部和细长的尾部组成，见图2。 头部平面轮廓为正六边形，直径约为40 nm，尾部长约220 nm、宽约10 nm。 根据有关噬菌体的分类[3]，vB_EcoS214 属于长尾噬菌体。

图2 噬菌体vB_EcoS214 的电镜照片

2.3 噬菌体vB_EcoS214 的裂解谱 裂解谱测定结果表明： 在复苏的21 株菌中， 噬菌体vB_EcoS214可以裂解其中4 株大肠杆菌， 裂解率为19.05%，见表1。

表1 噬菌体vB_EcoS214 的裂解谱

3 讨 论

噬菌体作为一种绿色天然的 “抗菌药物”，因其制剂安全性高、 特异性强和研发周期短等， 有望作为“后抗生素时代”的治疗方法[4]。 本研究从鸭场污水样品中成功分离到1 株能裂解鸭源大肠杆菌的噬菌体，将其命名为vB_EcoS214。电镜下观察，该噬菌体由1 个直径约为40 nm 的头部和一根长约220 nm 的尾部组成， 全长约260 nm。 根据有关噬菌体的分类[3]，vB_EcoS214 属于长尾噬菌体。噬菌体vB_EcoS214 能够特异性裂解4 株大肠杆菌，裂解率为19.05%，其裂解力略高于赵尊福等[5]所分离的噬菌体Bp16，低于姚澜等[6]所分离的噬菌体vB_E coS_AH50 及刘畅等[7]所分离的噬菌体VB_EcoMZQ1。 目前噬菌体的裂解谱窄制约了其临床应用，有学者探索研制噬菌体鸡尾酒， 即组合多个噬菌体来拓宽噬菌体裂解谱[8]，以期突破单个噬菌体裂解谱窄的难题。 噬菌体vB_EcoS214 的裂解谱较宽，显示其具有制备噬菌体鸡尾酒的潜力， 该噬菌体生物学特性等还需要进一步深入研究。

4 结 论

本研究成功分离鉴定了一株能裂解鸭源大肠杆菌的噬菌体vB_EcoS214，属长尾病毒科。 该噬菌体有较宽的裂解谱，裂解力较强，可成为噬菌体鸡尾酒制剂的候选噬菌体。该噬菌体的成功分离，为鸭大肠杆菌病的噬菌体疗法提供参考。