鉴定大肠埃希菌O157:H7的表型特征探讨

马 爽，何冬梅，林 铿，马 翔

(1.广州市花都区妇幼保健院检验科，广东广州510800；2.广东省疾病预防控制中心，广东广州511430；3.广州花都人爱医院，广东广州 510800)

致泻性大肠埃希菌包括产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)，侵袭性大肠埃希菌(EIEC)，产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)，肠致病性大肠埃希菌(EPEC)和肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)。其中，STEC能导致血性腹泻、出血性肠炎，甚至严重的溶血性尿毒症综合征(HUS)，国内外已有报道[1-3]。但是，大肠埃希菌O157:H7为典型的大肠埃希菌特征，常规方法不能识别出来。笔者观察到粪便标本中的多数大肠埃希菌的MUG和山梨醇阳性，而大肠埃希菌O157:H7标准菌株的MUG和山梨醇均阴性。为此，通过对大肠埃希菌的MUG和山梨醇2项试验的单独和联合试验的结果分析，探讨大肠埃希菌O157:H7鉴定的实用方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1培养基 哥伦比亚血平板、麦康凯平板、山梨醇麦康凯平板购自广州市迪景微生物科技有限公司，大肠埃希菌O157显色平板购自法国科玛嘉公司。诊断血清：大肠埃希菌诊断血清购自丹麦国家血清研究院。OK O Pool 1血清(内含O157血清型)批号：P1Q1-2H1，有效期2021-07-30； O157单价血清批号：O157 K1-1H2，效期2020-01-03；H7单价血清批号：H7E1-H15，效期至2021-06-06，均在有效期内。

1.1.2生化管 MUG和山梨醇生化管购自杭州滨河微生物试剂有限公司，均在有效期内。

1.1.3试验菌株 大肠埃希菌O157:H7(ATCC 43888)、大肠埃希菌O157:H7(NCTC 12900)、大肠埃希菌O157:H7(卫生部室间质评菌株1708)3株标准菌株以及大肠埃希菌ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC各1株，均为本室收藏质控菌株。

1.1.4临床菌株 2018年4月至2019年2月广州市花都区餐饮从业人员粪便(肛拭子)中随机检出的大肠埃希菌357株。

1.2仪器与试剂 ATB半自动微生物仪及32E鉴定条和吲哚试剂、VITEK 2-compact全自动微生物仪及革兰阴性菌鉴定卡(GN卡)，法国生物梅里埃公司生产，鉴定条、鉴定卡及试剂均在有效期内。基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪(VITEK MS)，法国梅里埃公司生产。DHP-9052电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司生产。ZF-80型暗箱四用紫外线分析仪，上海嘉鹏科技有限公司生产。

1.3方法 通过实验菌株的菌落特征、MUG和山梨醇发酵试验结果以及自动化仪器鉴定、血清学试验鉴定大肠埃希菌O157:H7，找出该菌的鉴定特征。用哥伦比亚血平板复苏大肠埃希菌O157:H7、ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC六种菌，同时接种MUG和山梨醇生化管，并划线接种麦康凯平板、山梨醇麦康凯平板、大肠埃希菌O157显色平板观察菌落特征，并做玻片法血清学凝集试验。健康体检人员的粪便拭子划线接种山梨醇麦康凯平板，35 ℃孵育18～24 h，挑选无色透明(山梨醇阴性)、红色(山梨醇阳性)菌落转种哥伦比亚血平板经35 ℃孵育18～24 h，取革兰阴性、氧化酶阴性的培养物，用ATB进行生化鉴定，鉴定出的大肠埃希菌(选择好的或者极好的鉴定菌株)接种MUG和山梨醇生化管。对MUG阴性或山梨醇阴性以及2项试验均阴性的大肠埃希菌划线接种麦康凯平板、大肠埃希菌O157显色平板，观察菌落特征并做玻片法血清凝集试验。对3株大肠埃希菌O157:H7及ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC共8株菌全部用ATB半自动微生物仪、VITEK 2-compact、VITEK MS鉴定。对粪便中检出的MUG和山梨醇2项试验均阴性的大肠埃希菌(已经ATB半自动微生物仪鉴定)，再用VITEK 2-compact鉴定。过夜的MUG培养液在紫外线下观察荧光，阳性菌株为蓝绿色荧光；山梨醇发酵，培养基由紫变黄。每批试验用大肠埃希菌ATCC 25922做阳性对比，大肠埃希菌O157:H7做阴性对比。用3株大肠埃希菌O157:H7标准菌株和1株大肠埃希菌ATCC 25922标准菌株质控实验条件。

2 结 果

质控菌株的MUG和山梨醇以及血清学试验质量控制合格，3株大肠埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇均阴性、与大肠埃希菌O157多价、O157单价及H7单价血清凝集。其他的大肠埃希菌结果明确。MUG和山梨醇试验及大肠埃希菌O157:H7血清学试验的质量控制结果如下。MUG(+)山梨醇(+)：大肠埃希菌ATCC 25922；MUG(-)山梨醇(-)为O157:H7 ATCC 43888、O157:H7 NCTC 12900、O157:H7卫生部质评菌1807；O157:H7血清学(+)为O157:H7 ATCC 43888、O157:H7 NCTC 12900、O157:H7卫生部质评菌1807; O157:H7血清学(-)为大肠埃希菌ATCC 25922。

3株大肠埃希菌O157:H7菌在麦康凯平板上为红色菌落(乳糖阳性)，在山梨醇麦康凯平板上为无色透明菌落(山梨醇阴性)，在大肠埃希菌O157显色平板为紫红色菌落，见图1。EPEC O111发酵乳糖，不发酵山梨醇，在麦康凯平板和山梨醇麦康凯平板上的菌落特征与大肠埃希菌O157:H7相似，但在O157显色平板上的绿色菌落可区别；ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EAEC因发酵乳糖和山梨醇，在麦康凯平板和山梨醇麦康凯平板上均为红色菌落，在大肠埃希菌O157显色平板为蓝色、绿色菌落，这些大肠埃希菌的菌落特征相同，见表1。

图1 大肠埃希菌O157:H7菌落及菌体特征

表1 大肠埃希菌O157:H7及其他大肠埃希菌的表型特征

三株大肠埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇试验均阴性；EPEC O111的MUG阳性，山梨醇阴性；其他的菌株2项试验均阳性，见图2，图3；山梨醇试验结果与山梨醇麦康凯平板菌落特征吻合。

试验的菌株中，3株大肠埃希菌O157:H7均与大肠埃希菌O157、大肠埃希菌H7血清凝集，其他的5株大肠埃希菌血清学试验阴性。

三株大肠埃希菌O157:H7经ATB半自动微生物仪鉴定为大肠埃希菌(好的或者极好的鉴定)，VITEK MS鉴定也是大肠埃希菌，因此，这两种仪器均不能明确鉴定大肠埃希菌O157:H7。但是VITEK 2-compact鉴定为大肠埃希菌O157，提示高致病微生物，需进行血清学确认。其他5株大肠埃希菌均被3种自动化仪器鉴定为大肠埃希菌。

图2 普通大肠埃希菌和致泻大肠埃希菌的MUG试验

粪便中的357株大肠埃希菌经ATB半自动微生物仪鉴定，均为好的或极好的鉴定。山梨醇试验结果与山梨醇麦康凯平板上的菌落特征吻合，MUG和山梨醇试验结果及在这几种平板上的菌落特征见表2。此外，筛选出的MUG阴性或山梨醇阴性及2项试验均阴性的95株大肠埃希菌与O157血清不发生凝集，从健康体检者粪便中没有检出大肠埃希菌O157:H7。

图3 普通大肠埃希菌和和致泻大肠埃希菌的山梨醇试验

表2 357株健康体检者粪便大肠埃希菌的表型特征

3 讨 论

大肠埃希菌O157:H7的MUG阴性，山梨醇阴性[1,3-5]，有两个血清型，85%为O157:H7(有动力)，12%为O157:HNM(无动力)，3%是H7以外的H型。由于临床微生物室通常不将其作为目的菌，且此菌在麦康凯平板上是红色菌落，可能作为非致病菌排除。

来自粪便中的357株大肠埃希菌，未检出O157:H7，可能与健康人群带菌率低有关。虽然，根据MUG或山梨醇单一试验可以筛查O157[6-8],但有较高的假阳性，因MUG和山梨醇均阴性的大肠埃希菌只有2.2%，故选择“双阴”菌株作进一步鉴定，特别在大批量标本筛查时省时省力、且节省血清。单独的山梨醇麦康凯平板、大肠埃希菌O157显色平板筛查不及MUG和山梨醇2项试验联合应用[9-12]，使用VITEK 2-compact成本昂贵，不适合大批量筛查。

大肠埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇均阴性，直接用于可疑菌筛查简便易行，此特征是其他的致泻性大肠埃希菌所没有的，在各种致泻性大肠埃希菌筛查中有明确的鉴别作用。有报道极少的MUG阳性的大肠埃希菌O157菌株检出[5]，此种情况下表型特征不适合其鉴别。此外，应注意粪便中常见的摩根摩根菌MUG和山梨醇均阴性，少见的蜂房哈夫尼亚菌也是阴性。粪便中的铜绿假单胞菌(常见)和恶臭假单胞菌的MUG阳性(这2种菌自身也产生荧光)，二者都不发酵山梨醇。

MUG快速法可在4 h出结果，应注意阴性的大肠埃希菌在延长培养后阳性。不要盲目加快速度，对可疑菌株延长观察时间，以保证结果的准确。

大肠埃希菌O157:H7在O157显色平板上为紫红色菌落，着色明显，而非大肠埃希菌O157:H7的菌落为蓝色、绿色，有良好筛查作用,其平板成本较高。来自粪便的357株大肠埃希菌在O157显色平板上为蓝色、绿色菌落。同时应排除其他细菌在O157显色平板上的紫红色菌落[13]。此外，笔者在试验中观察到沙门菌属中的某些血清型，如肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌在O157显色平板上也是紫红色菌落，需引起重视。大肠埃希菌O157:H7在山梨醇麦康凯平板上为无色透明菌落，且价廉，与MUG组合筛查为佳。麦康凯平板及ATB 半自动微生物仪和VITEK MS均不适合大肠埃希菌O157:H7的筛查。

MUG和山梨醇发酵试验简便易行，成本低廉，不受试验条件限制，适合各级实验室；山梨醇麦康凯平板及大肠埃希菌O157显色平板也有较好的筛查作用。VITEK 2-compact能明确筛查大肠埃希菌O157，并提示为高致病微生物，但是成本昂贵，不适合大批量标本的筛查，可用于筛查出菌株的补充鉴定。对筛查出的菌株必须用血清学试验鉴定。包括无动力或H7抗原阴性的菌株应送上级实验室进行毒素或毒素基因的检测和确认。

通过分析大肠埃希菌O157:H7三株标准菌株以及ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC、临床标本中的大肠埃希菌在VITEK 2-compact GN卡中的48项试验结果，发现其中的山梨醇和β-葡萄糖醛酸酶2项试验是区别大肠埃希菌O157与其他大肠埃希菌的关键特征，而MUG可以鉴定产β-葡萄糖醛酸酶的细菌[14]。因此，MUG和山梨醇试验作为鉴定大肠埃希菌O157:H7的首选试验。

MUG和山梨醇发酵试验联合应用，对大肠埃希菌O157:H7有较高的筛查准确率，效果优于其他方法，但必须经血清学鉴定。