宫颈上皮非典型增生与阴道微生态的关系研究

徐忠淑,杨 刚,徐 敏

(重庆市武隆区妇幼保健院检验科，重庆 408500)

宫颈癌是威胁全球妇女健康最为严重的疾病之一，是女性生殖道发病率和病死率最高的恶性肿瘤。宫颈上皮非典型增生是一种癌前病变，从非典型增生发展至原位癌的一系列连续的癌前病变过程也称为子宫颈上皮内瘤变(CIN)[1]。阴道为开放性腔道，是人体内重要微生态区，正常情况下是以乳杆菌等优势菌为主组成的微生态系统，阴道微生态是一个非常灵敏的系统，在受到内源性和外源性因素影响时，很容易发生改变，继而导致疾病的发生。研究已证实人乳头状病毒(HPV)持续感染是导致宫颈上皮非典型增生的重要原因，也有研究指出阴道微生态失衡后可导致生殖系统炎症及外阴发生上皮内非瘤样病变[2]，阴道细菌性疾病与CIN的发生具有密切关系[3]。HPV感染、宫颈上皮非典型增生与阴道微生态变化之间的关系尚不明确。因此，本研究对宫颈上皮非典型增生患者的阴道微生态情况进行分析，旨在揭示这两者之间可能存在的关系，从而为宫颈癌的早期防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2017年1-12月在本院体检的234例已婚女性采用宫颈脱落细胞学(TCT)检查，采集标本进行HPV-DNA 分型检测，并在阴道镜下采集宫颈组织进行病理学诊断。根据细胞学和病理诊断结果，将细胞学诊断为无明确诊断意义的鳞状细胞病变(ASCUS)但病理结果正常者作为对照组，CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组为实验组。其中，对照组91例，平均年龄(35.8±13.5)岁；CINⅠ组78例，平均年龄(37.2±13.7)岁；CINⅡ/Ⅲ组65例，平均年龄(36.3±15.1)岁。纳入标准：年龄20～65岁，无宫颈锥切病史、检查前3 d未同房、近1个月内未进行阴道相关疾病治疗、对本研究知情同意。排除标准：宫颈腺细胞异常者、ASCUS及以上病变严重程度者、妊娠期或哺乳期、生殖器官其他感染性疾病患者、免疫功能低下或免疫性疾病患者、恶性肿瘤患者、合并其他严重脏器疾病患者。

1.2方法 常规方法采集患者的阴道分泌物，进行阴道微生态检测，具体包括：(1)采用涂片革兰染色法，在显微镜下检查阴道分泌物中的滴虫、念珠菌、线索细胞等微生物情况；(2)用pH精密试纸测定阴道pH;(3)爱必维试剂盒检测患者的阴道微生物功能情况，首先将试剂盒复温至室温，取出反应装置并在反应装置的5个孔中各滴加一滴经处理过的阴道分泌物样品，在“唾液酸苷酶”反应孔中滴加一滴“显色液A”，置于37 ℃水浴10 min，在“凝固酶”反应孔中滴加一滴“显色液B”，继续37 ℃水浴3 min后判读结果，具体检测方法及结果判读参照试剂盒的说明书。用生理盐水冲洗宫颈及阴道上1/3，回收冲洗液并2 000 r/min离心10 min，收集上清。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测阴道灌洗液中细胞因子水平情况，具体包括人树突状细胞趋化因子(CCL22)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素10(IL-10)3种细胞因子。常规方法采集宫颈口分泌物标本，采用亚能生物HPV(23 型)分型检测试剂盒进行HPV分型检测，该试剂盒采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术，主要步骤有HPV DNA提取、PCR扩增、杂交、洗膜、显色等，严格按照试剂盒的说明书进行操作，显色后进行结果判定。在阴道镜下采集病变明显部位的宫颈组织，由病理科进行病理诊断。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计软件，计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验；多因素分析采用多分类logistic回归分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1阴道分泌物检测阴道微生态情况 阴道微生态正常者43例，占18.38%(43/234)；阴道微生态异常者191例，占81.62%(191/234)。CINⅠ组和CINⅡ/Ⅲ组的阴道pH值均显著高于对照组，CINⅡ/Ⅲ组高于CINⅠ组，差异具有统计学意义(P<0.05)。各组研究对象的微生物菌群检测结果比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2阴道灌洗液细胞因子表达情况 随着宫颈上皮非典型增生程度加重，阴道灌洗液中的IL-10水平逐渐降低，其中CINⅡ/Ⅲ组显著低于CINⅠ组和对照组，CINⅠ组低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。另两种细胞因子水平在不同组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组研究对象的阴道微生态检测情况比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与CINⅠ组比较，△P<0.05

表2 3组研究对象阴道灌洗液细胞因子表达情况比较 (pg/mL)

注：与对照组比较，*P<0.05；与CINⅠ组比较，△P<0.05

表3 3组研究对象宫颈脱落细胞中HPV感染情况比较[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05；与CIN Ⅰ组比较，△P<0.05

2.3宫颈脱落细胞中HPV感染情况 随着宫颈上皮非典型增生程度加重，HPV阳性率逐渐升高，其中CINⅡ/Ⅲ组均高于对照组和CINⅠ组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4宫颈上皮非典型增生的危险因素分析 将病变程度作为因变量，上述分析得出有统计学意义的指标作为自变量，进行多因素logistic回归分析。变量设为X1、X2、X3，因素分别为HPV感染(阳性=1；阴性=2)、阴道pH值(pH≤4.5=1；pH>4.5=2)、IL-10表达(IL-10≤400 pg/mL=1；IL-10>400 pg/mL=2)、病变程度(对照组=0；CINⅠ=2；CINⅡ/Ⅲ=3)。结果显示：阴道pH值升高、IL-10表达降低及HPV阳性均是宫颈上皮发生非典型增生的危险因素。宫颈上皮非典型增生影响因素logistic分析见表4。

表4 宫颈上皮非典型增生影响因素logistic分析

注：-表示无数据

3 讨 论

阴道在解剖上是半开放通道结构，有多种微生物生存，形成局部的微生态系统，且通常情况下阴道具有维持微生态系统动态平衡的能力，取决于机体的内分泌功能情况及阴道的局部免疫状况[6]。菌群生态平衡的任何改变对疾病的发生发展影响甚大，当因某些原因导致阴道微生态平衡被打破时，部分微生物菌群可能大量繁殖，从而导致阴道及宫颈发生各种疾病，常见有泌尿生殖道炎症、外阴上皮内出现非瘤样病变等[7-8]。近年来的一系列研究已经证实持续感染高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)是发生宫颈肉瘤样病变及宫颈癌的最重要的危险因素，本研究分析结果也显示HPV阳性是宫颈上皮非典型增生的危险因素，且HPV感染阳性率越高，病变程度越重。究其原因，pH值是维持阴道微生态平衡的重要因素，健康女性的阴道pH值介于3.8～4.5，弱酸性环境的维持得益于阴道内乳酸杆菌及机体雌激素维持动态平衡，一方面有助于抑制致病菌的生长繁殖，同时乳酸杆菌还通过调节其自身生长情况来阻止外环境中致病菌的侵入[9-10]。有研究指出，当阴道内乳酸杆菌数量减少、阴道菌群失调或免疫功能受到抑制时，pH值可出现升高[11]。本研究分析结果显示，CINⅠ组和CINⅡ/Ⅲ组的阴道pH值均显著高于对照组，且CINⅡ/Ⅲ组高于CINⅠ组,差异有统计学意义(P<0.05)，多因素分析结果显示阴道pH值升高是宫颈上皮非典型增生的危险因素。考虑到pH 值升高，阴道内乳酸杆菌的生长受到抑制，菌群平衡被打破，进而可导致患者出现HPV持续感染；而HPV感染又进一步加剧阴道菌群失衡，使局部的免疫微环境形成的生物屏障遭到破坏，进而使宫颈局部的免疫功能出现异常，形成恶性循环，导致宫颈病变[12-13]。pH值作为阴道微生态平衡状况的一项重要指示指标，与阴道微生物菌群的生长情况密切相关[14]，因而当阴道pH值变化时往往提示微生态平衡可能被打破，而微生态失衡是宫颈发生病变的重要危险因素。寻找各种体液生物标志物是肿瘤诊断或早期发现的重要技术手段，阴道灌洗液可被视作为最接近体液的一种局部体液，而局部微环境免疫状态的变化在局部体液中的各生物标志物的表现比在血液中的变化更为敏感，也更具特异性。既往一些研究指出宫颈发生CIN或HPV感染时，在患者的局部组织或血液中可出现IL-2、IL-10及CCL22等炎症指标的变化[15-16]，但在阴道灌洗液中的变化情况，国内外仍罕见相关报道，对其进行进一步探讨具有重要意义。另一方面，IL-10等细胞因子作为重要的免疫调节因子，在阴道内的局部免疫功能中发挥着重要作用[17]。IL-10具有双向调节肿瘤发生发展的功能，一方面可通过抗炎作用对肿瘤的生长起到抗肿瘤作用，另一方面又可通过负向免疫调节途径起到促进肿瘤生长的作用[18]。本研究结果显示，宫颈上皮非典型增生者(CINⅡ/Ⅲ组和CINⅠ组)阴道灌洗液的IL-10水平低于对照组，且CINⅡ/Ⅲ组低于CINⅠ组，多因素分析结果显示IL-10降低是宫颈上皮非典型增生的危险因素。提示IL-10 减低可以促进宫颈上皮非典型增生的发生。但也有研究发现在一些CINⅢ患者中可出现IL-10升高现象，而持续的 HPV 感染可能激发 IL-10 干扰正常的免疫系统，从而导致宫颈癌[19-21]。因此，可以认为阴道IL-10水平的异常变化对宫颈病变具有重要的提示作用，IL-10 水平降低与宫颈癌前病变的发生有关，其变化或可作为宫颈病变的预测因子，值得深入研究。至于在本组研究中未观察到IL-2和CCL22有明显变化，提示这两种细胞因子可能在宫颈上皮非典型增生期无明显变化，这与曹建芳[18]研究报道的结果基本一致。至于阴道细菌性疾病与宫颈上皮非典型增生之间的关系，目前研究结果尚存在较大的争议。HPV持续感染可破坏阴道局部免疫微环境生物屏障已得到诸多研究报道证实[19]。但本研究发现不同组别研究对象的微生物菌群检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，可能是研究对象较少或检测方法差异造成的，且本研究未比较HPV感染与未感染者在微生物菌群上的差异情况，这需要进一步探索。

综上所述，阴道微生态变化对宫颈上皮非典型增生具有重要影响，HPV感染、阴道pH值升高及细胞因子IL-10的降低是宫颈上皮非典型增生的危险因素。