副猪嗜血杆菌冻干保护剂试验研究

张小兰 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是革兰氏阴性多形态细菌， 是存在于猪上呼吸道的一种共栖菌[1]，该菌主要引起猪的纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等为特征的副猪嗜血杆菌病，也称格拉瑟病（Glasser′s diseas）[2]。 该病是影响全球养猪业最为严重的细菌性疾病之一， 给养猪行业带来巨大的经济损失， 疫苗免疫是预防和治疗该病的主要方法。菌种保藏是保证疫苗品质的关键因素，保藏是否得当直接影响菌种活性，影响菌液高密度发酵。冷冻真空干燥法是保藏微生物的主要方法之一，在冷冻干燥时添加适当的保护剂， 对减少微生物在冷冻干燥及长期保藏过程中的死亡和变异起着至关重要的作用[3]。 但每种微生物对添加的保护剂种类、浓度和配比等有不同需求， 需要试验摸索才能得到最佳冻干效果。 目前对于副猪嗜血杆菌冻干保护剂研究的报道相对较少， 本试验从牛乳蔗糖和明胶蔗糖2 种常规冻干保护剂着手， 设计6 组保护剂与菌液不同冻干配比进行试验， 筛选1 组最佳的冻干保护剂及配比， 再进行6 次不同血清型菌株的冻干验证以及菌种-20 ℃保存1 年、2 年、3 年活菌数变化试验，最终通过冻干的物理性状、菌种存活率、复苏情况、菌种保存条件和时间对活菌数影响等指标，考察冻干效果， 确定一种适合副猪嗜血杆菌菌种冻干的保护剂配方。

1 材料与方法

1.1 菌种 副猪嗜血杆菌4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株， 由广东省农业科学院动物卫生研究所鉴定，兆丰华生物科技（福州）有限公司实验室保存。

1.2 培养基及试剂 胰酪大豆胨固体培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB），购自广东环凯微生物科技有限公司；酵母粉，购自OXOID 公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），购自广州美津生物技术有限公司；牛血清，购自山西润生大业生物材料有限公司。

1.3 仪器 TS-2102C 恒温摇床， 购自上海捷呈实验仪器有限公司；全自动真空冷冻干燥机，购自楚天科技股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 HPS 菌液制备 将冻干副猪嗜血杆菌4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株分别用TSB 液体培养基（10%牛血清，16 μg/mL NAD，下同）溶解后， 接种TSA 固体培养基 （10%牛血清，16 μg/mL NAD， 下同） 平板上，37 ℃静置培养24 h， 连续传2 代。 挑取典型单菌落接种5 mL TSB 液体培养基，37 ℃、200 r/min 振荡培养8～10 h，取新鲜培养菌液，按1∶50 比例接种TSB 液体培养基， 扩大培养8～10 h，收集菌液，作为冻干菌液备用。

1.4.2 牛乳蔗糖保护剂制备 称取5 g 蔗糖、10 g脱脂乳粉置于玻璃瓶中搅拌、溶解，注射用水定容至100 mL，116 ℃高压灭菌30 min，冷却后置2～8 ℃保存备用。

1.4.3 明胶蔗糖保护剂制备 称取8 g 明胶， 用水浴加热法将明胶搅拌溶解完全， 再称取、 加入40 g蔗糖充分搅拌溶解， 注射用水定容至100 mL，116 ℃高压灭菌30 min，冷却后置37 ℃保存备用。

1.4.4 活菌计数 按照 《中华人民共和国兽药典》（2020 版）三部附录3405 中的表面培养测定法进行活菌计数。

1.4.5 真空冷冻干燥 试验样品入箱。 冻干曲线设定：-42 ℃预冻3 h；7 ℃一次升华，18 pa 运行8 h；28 ℃二次升华，0.5 pa 运行3 h。

1.5 冻干存活率计算 冻干存活率=冻干后样品活菌总数/冻干前样品活菌总数×100%。

1.6 冻干试验 将制备好的4 型H25 株HPS 菌液、 牛乳蔗糖保护剂和明胶蔗糖保护剂按表1 配方进行试验， 冻干后每瓶进行物理性状检查， 抽样计数，加入TSB 恢复冻干前体积，测定冻干菌种存活率和菌种复苏情况。

表1 冻干试验分组

1.7 冻干试验验证 在冻干试验的基础上，筛选最佳的菌液与保护剂配方， 分别用4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株菌液进行冻干验证， 每个菌株验证2 次，观察冻干后的物理性状，测定冻干存活率、菌种复苏情况。

1.8 保存条件及时间 将冻干菌种置于-20 ℃冰柜保存， 并于保存后的1 年、2 年、3 年进行活菌计数，绘制曲线，观察活菌数变化情况、菌种复苏情况。

2 结果与分析

2.1 冻干试验 4 型H25 株菌液与冻干保护剂按不同比例混合，冻干结果见表2。 从物理性状检查来看，只有试验4 组和试验5 组的物理性状合格，冻干后呈海绵状、疏松、微黄色、遇水速溶。 从存活率来看，试验4 组的存活率为64.2%，试验5 组的存活率为70.4%，试验5 组的存活率高于试验4 组，且试验5 组菌种复苏情况正常。 综上三点因素，筛选出试验5 组即牛乳蔗糖保护剂与菌液为2∶1 的比例作为最佳保护剂配方。

表2 冻干保护剂与菌液不同配比冻干试验结果

2.2 冻干验证 用试验5 组配方即牛乳蔗糖保护剂与菌液为2∶1 的比例进行6 次不同血清型菌株的冻干验证试验。 从表3 可以看出，无论是HPS 4 型H25 株、5 型H45 株还是12 型H31 株，其冻干的物理性状均合格，复苏后的菌体形态、长势均正常，存活率达72.2%及以上。从数据结果来看，不同菌株的存活率不一样， 菌株存活率由高到地依序为12 型H31 株、5 型H45 株、4 型H25 株。

表3 不同菌株冻干验证结果

2.3 保存条件及时间 HPS 4 型H25 株、5 型H45株和12 型H31 株冻干菌于-20 ℃冰柜保存，分别在保存1 d、1 年、2 年、3 年取样计数，观察细菌复苏情况，结果见表4。 三种菌株在-20 ℃保存1 d、1 年、2年和3 年分别复苏，菌体形态、长势均正常，菌种活力未受影响。 三种菌株活菌数随着保存时间延长呈缓慢下降趋势，但活菌滴度仍维持在108CFU/mL 以上，符合菌种保存的变化规律。

表4 不同血清型冻干菌-20 ℃保存不同时间活力测定结果

3 小结与讨论

研究表明， 采用牛乳蔗糖与菌液为2∶1 的比例冻干HPS，物理性状最好，存活率达到75%，以此配比再进行6 次冻干验证（4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株各冻干2 次），物理性状均合格，存活率均不低于72%。 菌种于-20 ℃保存1 年、2 年、3 年，活菌数滴度仍然维持在108CFU/mL 以上，活菌数没有明显下降，菌种复苏后菌体形态、长势等均正常。因此，采用牛乳蔗糖保护剂与菌液为2∶1 的比例，适合副猪嗜血杆菌冻干。

副猪嗜血杆菌病是严重危害养猪业的细菌传染病之一，随着国家减抗、禁抗进程加快，副猪嗜血杆菌病的防控采用疫苗免疫越来越普遍。 作为疫苗生产者，菌种制备、保存是疫苗上游制备的关键工序。目前大多数菌种长期保存方法是冷冻真空干燥法，其中冻干保护剂的种类、浓度、配比等在冻干过程中起重要作用，对微生物的保存效果都有明显影响。采用的冻干保护剂不仅要保证制品的良好冻后外观、溶解度，也要保证菌种的高存活率和稳定性。本试验筛选出适合副猪嗜血杆菌冻干用保护剂及配比，为副猪嗜血杆菌冻干菌种的制备和保存提供参考。