周小平 彭正武 陈书扬 刘茹 田涛 欧玉仑
郴州市第一人民医院眼科(湖南郴州 423000)
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤,视网膜母细胞瘤基因(Rb1)的丢失或突变可导致视网膜母细胞瘤的发生[1]。RB 的治疗包括局部靶向治疗、放射治疗和化学疗法。尽管有多种治疗选择,但其具有一定的副作用和并发症,包括多药耐药和化疗不敏感,严重影响治疗效果[2]。因此,明确RB 发展的基本机制,探索RB 治疗的生物标志物和新靶点是当务之急。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200 nt,没有蛋白质编码功能的转录本。大量研究[3-4]证实,lncRNAs参与多种生物学过程的调控,包括细胞增殖、凋亡、转移和基因组稳定性。近年来的研究[5]表明,lncRNAs的异常表达与RB的发生发展有关。例如,lncRNA H19 通过竞争性结合miR-17-92 抑制RB 细胞增殖,诱导细胞凋亡。LncRNA HOXA11-AS通过海绵化miR-506-3p 增强Rb 进程[6]。最近的一项研究[7]发现lncRNA 序列相似家族83 成员A-反义核糖核酸1(family with sequence similarity 83 member A antisense RNA 1,FAM83A-AS1)作为致癌基因,促进肺腺癌的进展。然而,FAM83A-AS1 在RB 癌变过程中的生物学功能及潜在的分子机制尚未明确。miRNAs 是研究最广泛的非编码RNA,可以直接与lncRNAs 相互作用并调节细胞过程,包括个体发育、机体代谢和肿瘤发生。研究发现,FAM83A-AS1 通过调控miRNA 在许多肿瘤细胞中发挥致癌作用。例如,FAM83A-AS1 通过靶向miR-150 促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭[8]。然而,RB 中FAM83A-AS1 与miR-150 之间的相关性尚不清楚。因此,本研究旨在探讨lncRNA FAM83AAS1 在RB 进展中的作用及其潜在的分子机制,研究经本院伦理委员会审核通过。
1.1 试剂和仪器人视网膜母细胞瘤细胞(SORB50 和HXO-RB44)和人正常视网膜上皮细胞(ARPE-19)均购自中国科学院上海细胞库;MTT试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司;SYBR Premix Ex TaqⅡ购自日本TaKaRa 公司;miRNA 荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司;高迁移率族蛋白A2(high-mobility group protein A2,HMGA2)抗体购自美国Abcam 公司;Annexin VFITC/PI双染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Vector、pcDNA-FAM83A-AS1、NC-siRNA、FAM83AAS1-siRNA、NC mimic、miR-150 mimic 质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司。多功能酶标仪购自德国BMG LABTECH 公司;7300 型实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司;流式细胞仪购自德国PARTEC 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养与转染将人视网膜母细胞瘤细胞(SO-RB50、HXO-RB44和Y79)和人正常视网膜上皮细胞(ARPE-19)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 链霉素的RPMI-1640 培养基中培养,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。将SO-RB50细胞(1 × 105)接种至6 孔板中,当细胞融合度达到80%时,根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000 试剂将Vector、pcDNA-FAM83A-AS1、NCsiRNA、FAM83A-AS1-siRNA、AM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor、FAM83A-AS1-siRNA+miR-150 inhibitor、NC mimic、miR-150 mimic、miR-150 mimic+Vector、miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2 分别转染至SO-RB50 细胞中。转染48 h 后,收集细胞进行后续实验。
1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验使用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA。随后使用PrimeScript RT 试剂盒将mRNA、lncRNA 逆转录为cDNA,使用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒将miRNA 逆转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ或miRNA 荧光定量RT-PCR 检测试剂盒在7300型实时荧光定量PCR 系统中进行PCR 反应以检测mRNA、lncRNA 或miRNA 的相对表达。反应条件为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 min,共40 个循环。GAPDH 用作检测mRNA 和lncRNA的内部对照,U6 用作检测miRNA 的内部对照。根据2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
1.2.3 MTT 实验使用MTT 试剂盒检测细胞增殖能力。将转染后的细胞置于96 孔板中常规培养,24 h 后每孔加入10 μL MTT 溶液并孵育4 h。PBS 冲洗后,每孔加入100 μL DMSO 溶液,静置2 h。最后使用酶标仪测量在450 nm 波长处的吸光度(A)值。
1.2.4 流式细胞术使用Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒检测细胞凋亡。首先用预冷PBS 冲洗处理过的细胞,悬浮在密度为1 × 106个细胞/mL 的结合缓冲液中。将100 μL 细胞悬液转移至5 mL 离心管中,并与5 μL Annexin V 和10 μL PI 避光孵育15 min。最后,在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。
1.2.5 Western blot使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解处理后的细胞提取总蛋白。然后用10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离等量的蛋白质样品并转移到PVDF 膜上。PVDF 膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h 后,与一抗在4 ℃下孵育过夜。随后,加入相应的二抗并在室温下孵育1 h。使用增强化学发光法将蛋白条带可视化。GAPDH 用作检测蛋白质表达的内部对照。
1.2.6 双荧光素酶报告基因实验使用双荧光素酶报告基因实验验证FAM83A-AS1和miR-150以及miR-150 和HMGA2 之间的靶向关系。将FAM83AAS1 或HMGA2 的野生型(WT)或突变型(MUT)3'-UTR 分别克隆到荧光素酶载体pGL3 中。接下来,通过Lipofectamine 2000 转染试剂将荧光素酶载体和miR-150 mimic/NC mimic 共转染到细胞中,培养48 h。最后,收集细胞,使用双荧光素酶报告基因试剂盒在酶标仪上检测荧光素酶活性。
1.3 统计学方法使用SPSS 21.0 软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差表示。数据采用Studentt检验或单因素方差分析进行显著性检验。以P< 0.05 为差异有统计学意义。
2.1 FAM83A-AS1 在RB 细胞系中的表达RTqPCR 结果显示,FAM83A-AS1 在人视网膜母细胞瘤细胞(SO-RB50、HXO-RB44 和Y79)和人正常视网膜上皮细胞(ARPE-19)中的表达分别为(2.85 ±0.21)、(3.07 ± 0.27)、(3.54 ± 0.32)和(1.00 ± 0.09),与人正常视网膜上皮细胞(ARPE-19)比较,人视网膜母细胞瘤细胞(SO-RB50、HXO-RB44 和Y79)中FAM83A-AS1的表达均显著升高(t= 14.043、12.598、13.235,P< 0.05),并且在Y79 细胞中FAM83A-AS1表达水平最高。因此,本研究选择Y79 细胞系进行后续实验(图1)。
图1 FAM83A-AS1 在RB 细胞系中的表达Fig.1 Expression of FAM83A-AS1 in RB cell line
2.2 过表达或敲低FAM83A-AS1对RB细胞增殖和凋亡的影响RT-qPCR结果显示,pcDNA-FAM83AAS1 组细胞中FAM83A-AS1 的表达显著高于Vector组,差异有统计学意义(P< 0.05)。FAM83A-AS1-siRNA 组细胞中FAM83A-AS1 的表达显著低于NC-siRNA 组,差异有统计学意义(P< 0.05)。MTT实验和流式细胞术结果显示,与Vector 组比较,pcDNA-FAM83A-AS1 组细胞增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC-siRNA组比较,FAM83A-AS1-siRNA 组细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,差异均有统计学意义(P< 0.05,表1)。
表1 各组细胞中FAM83A-AS1 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.1 Comparison of FAM83A-AS1, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
表1 各组细胞中FAM83A-AS1 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.1 Comparison of FAM83A-AS1, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
注:与Vector组比较,aP < 0.05;与NC-siRNA组比较,bP < 0.05
组别Vector组pcDNA-FAM83A-AS1组NC-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA组F值P值凋亡率(%)12.53 ± 1.14 6.04 ± 0.52a 11.28 ± 1.37 26.15 ± 2.08b 113.487< 0.05例数3 3 3 3 FAM83A-AS1 1.00 ± 0.08 3.11 ± 0.29a 0.98 ± 0.09 0.45 ± 0.04b 166.151< 0.05细胞增生值(A)0.58 ± 0.05 0.87 ± 0.07a 0.61 ± 0.04 0.29 ± 0.03b 68.232< 0.05
2.3 FAM83A-AS1靶向并调控miR-150的表达双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-150 过表达降低了WT-FAM83A-AS1 的荧光素酶活性(t=10.262,P< 0.05),但其对MUT-FAM83A-AS1 荧光素酶活性没有影响(t= 0.287,P>0.05)。pcDNAFAM83A-AS1 组细胞中miR-150 的表达显著低于Vector 组,差异有统计学意义(t= 10.904,P< 0.05,图2)。
图2 FAM83A-AS1 靶向并调控miR-150 的表达Fig.2 FAM83A-AS1 targets and regulates the expression of miR-150
2.4 FAM83A-AS1通过靶向miR-150对RB细胞增殖和凋亡的影响与NC-siRNA 组比较,FAM83AAS1-siRNA 组RB 细胞中miR-150 水平显著升高,细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高;与FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor 组比较,FAM83AAS1-siRNA+miR-150 inhibitor 组RB 细胞中miR-150水平显著降低,细胞增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P< 0.05,表2)。
表2 各组细胞中miR-150 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.2 Comparison of miR-150 level, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
表2 各组细胞中miR-150 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.2 Comparison of miR-150 level, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
注:与NC-siRNA组比较,aP < 0.05;与FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor组比较,bP < 0.05
组别NC-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor组FAM83A-AS1-siRNA+miR-150 inhibitor组F值P值凋亡率(%)9.06 ± 0.61 21.43 ± 1.82a 20.11 ± 1.63 11.56 ± 0.96b 62.457< 0.05例数3 3 3 3 miR-150 1.00 ± 0.08 3.06 ± 0.26a 3.14 ± 0.33 1.58 ± 0.14b 44.689< 0.05细胞增生值(A)0.66 ± 0.06 0.29 ± 0.03a 0.32 ± 0.04 0.51 ± 0.05b 27.501< 0.05
2.5 miR-150 靶向并调控HMGA2 的表达通过生物信息学软件预测miR-150 和HMGA2 之间的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-150 mimic 显著降低了WT-HMGA2 的荧光素酶活性(t= 9.488,P< 0.05),但其对MUT-HMGA2荧光素酶活性没有影响(t= 0.405,P>0.05)。miR-150 mimic 组细胞中HMGA2 mRNA 水平的表达均显著低于NC mimic 组,差异均有统计学意义(t= 12.199,P< 0.05)。miR-150 inhibitor 组细胞中HMGA2 mRNA水平的表达均显著高于NC inhibitor组,差异均有统计学意义(t= 12.847,P< 0.05,图3)。
图3 miR-150 靶向并调控HMGA2 的表达Fig.3 miR-150 targets and regulates the expression of HMGA2
2.6 miR-150 通过靶向HMGA2 对RB 细胞增殖和凋亡的影响与NC mimic 组比较,miR-150 mimic 组RB 细胞中HMGA2 mRNA 和蛋白水平显著降低,细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高;与miR-150 mimic+Vector 组比较,miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2 组RB 细胞中HMGA2 mRNA和蛋白水平显著升高,细胞增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,表3)。
表3 各组细胞中HMGA2 mRNA、蛋白水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.3 Comparison of HMGA2 mRNA, protein levels, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
表3 各组细胞中HMGA2 mRNA、蛋白水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.3 Comparison of HMGA2 mRNA, protein levels, cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s
注:与NC mimic组比较,aP < 0.05;与miR-150 mimic+Vector组比较,bP < 0.05
组别NC mimic组miR-150 mimic组miR-150 mimic+Vector组miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2组F值P值凋亡率(%)8.12 ± 0.53 18.47 ± 1.24a 19.35 ± 1.36 11.56 ± 0.71b 55.724< 0.05例数3 3 3 3 HMGA2 mRNA 1.00 ± 0.09 0.37 ± 0.04a 0.39 ± 0.03 0.88 ± 0.08b 49.566< 0.05 HMGA2蛋白0.61 ± 0.08 0.28 ± 0.03a 0.29 ± 0.06 0.51 ± 0.05b 15.803< 0.05细胞增生值(A)0.71 ± 0.07 0.34 ± 0.03a 0.36 ± 0.05 0.59 ± 0.08b 17.392< 0.05
越来越多的研究发现,许多lncRNA 与各种生物学过程和疾病相关,包括癌症的进展。先前的证据也证明lncRNAs 的表达在多种癌症中存在失调,这些异常的lncRNAs 可能参与了癌症的进展[9-10]。研究[11-12发现,一些lncRNAs 作为致癌基因或抑癌基因在RB 的发生发展中发挥重要的调节作用]。例如,LncRNA ELFN1-AS1通过调控miR-4270/SBK1 轴促进RB 细胞生长和侵袭[13]。沉默LEF1-AS1 可通过调控Wnt/β-catenin 通路抑制RB细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。然而,FAM83A-AS1在RB 中的作用鲜有报道。本研究深入研究了FAM83A-AS1 在RB 中的作用和机制。首先,本研究评估了FAM83A-AS1 在RB 细胞系SO-RB50、HXO-RB44和Y79细胞中的表达。结果发现人视网膜母细胞瘤细胞(SO-RB50、HXO-RB44 和Y79)中FAM83A-AS1 的表达均显著高于人正常视网膜上皮细胞,且FAM83A-AS1 在Y79 细胞中表达最高。该发现与以往研究结果[15-16]类似,即FAM83A-AS1在胰腺癌中均较正常组织明显上调,FAM83A-AS1的高表达与胰腺癌不良预后呈正相关,FAM83AAS1 可促进胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭。本研究选取Y79 细胞进行进一步功能实验,结果显示过表达FAM83A-AS1 可显著促进RB 细胞增殖能力,抑制RB 细胞凋亡,而敲低FAM83A-AS1 可显著抑制RB 细胞增殖能力,促进RB 细胞凋亡。以上研究结果表明FAM83A-AS1 敲低在RB 中具有抗肿瘤作用。因此,FAM83A-AS1 可能成为一种新的治疗RB 的生物标志物和潜在的治疗靶点。
大量证据[17-19]表明,lncRNAs 可通过调节miRNAs 的表达发挥促癌或抑癌作用。其中,FAM83AAS1 可能通过调控不同的miRNAs 在不同的肿瘤中发挥其抗肿瘤作用。例如,lncRNA FAM83AAS1 通过与miR-495-3p 靶向结合,加重食管癌的恶性发展[20]。LncRNA FAM83A-AS1通过靶向miR-141-3p 促进肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化进程[21-22]。本研究通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验表明,FAM83A-AS1 靶向并负调控miR-150 的表达。本研究通过挽救实验进一步表明,抑制miR-150 可逆转FAM83A-AS1 沉默对RB 细胞增殖和凋亡的作用。以上结果表明,沉默FAM83A-AS1 可靶向miR-150 并发挥其抗肿瘤作用,可能为RB 的治疗提供了新的思路。
有学者研究[23]显示,miRNAs 在视网膜的生理功能以及疾病发生过程中发挥着重要作用,提示我们可以通过调控眼组织miRNAs 的表达来治疗并控制眼部疾病的发生、发展。然而,关于miR-150在RB 中的功能研究较少。有许多研究[24]表明miR-150 可作为肿瘤抑制因子参与肿瘤的发生发展,例如,miR-150 通过靶向Gli1 抑制结直肠癌细胞侵袭和转移。此外,研究[25]发现miR-150-5p 通过靶向PYCR1 表达来抑制鼻咽癌的进展。本研究结果发现,过表达miR-150 显著抑制RB 细胞增殖,促进细胞凋亡。以上数据表明,miR-150 在RB的进展中发挥了抗肿瘤作用。为了进一步阐明miR-150 对RB 进展的作用机制,本研究通过生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验预测和验证HMGA2 是miR-150 的靶基因。HMGA2 是高迁移率组蛋白家族成员之一,是一种染色质重塑因子,与DNA 中at 富集区域结合。HMGA2 的上调被认为是RB 患者临床预后较差的生物标志物,并且HMGA2 表达上调与RB 患者的不良预后相关[26]。本研究证明了miR-150 过表达抑制了RB 细胞中HMGA2 mRNA 和蛋白的表达。更重要的是,HMGA2 过表达逆转了miR-150 对RB 细胞进展的作用,提示miR-150 可能通过调控HMGA2 在RB中发挥抗肿瘤作用。
综上所述,本研究结果发现FAM83A-AS1 在RB 细胞中上调。敲低FAM83A-AS1 可抑制RB 细胞增殖,诱导RB 细胞凋亡。FAM83A-AS1 作为RB的致癌基因,其机制可能是通过靶向miR-150/HMGA2 轴参与RB 细胞的进展,提示FAM83A-AS1是RB 细胞中一种新的致癌lncRNA,是RB 诊断、预后和治疗的一种有前景的生物标志物。
【Author contributions】ZHOU Xiaoping: collected data and drafted the article; PENG Zhengwu, CHEN Shuyang: statistical analysis and technical support; LIU Ru, TIAN Tao, OU Yulun: designed the experiment and drafted the article.All of the authors declare that there is no conflict of interest.All authors read and approved the final manuscript as submitted.