三亚地区2019-2020年急性肠胃炎患者A群双埃可病毒的分子特征

黄丽菊 李泳枝 何欢 石挺丽 陈彩云 郑丽婷 梁敏仪 陈佳琪 陈清

1三亚中心医院（海南省第三人民医院）（海南三亚 572000）；2肇庆医学高等专科学校（广东肇庆 526020）；3南方医科大学（广州 510515）

急性胃肠炎是常见的感染性疾病，通常由病毒和细菌引起，目前病毒感染已成为急性胃肠炎发生的主要原因［1］。A 群双埃可病毒（Parechovirus-A，PeV-A）过去称为人双埃可病毒，是单链、正股RNA病毒，属于小RNA病毒科双埃可病毒属［2-4］。目前共发现了19种PeV-A的基因型（HPeV-1至HPeV-19），急性胃肠炎与多种基因型均有关［5］。国内外已经有一些PeV-A 相关的急性肠胃炎的流行病学研究［6-9］，热带地区是感染性腹泻的高发地区，但是目前尚未见我国热带地区PeV-A 感染的研究报道。因此，我们在2019-2020 年间，在三亚市某哨点医院开展了急性肠胃炎患者的PeV-A 监测和分子流行病学分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象和样本以门诊和住院诊断为急性肠胃炎的患者为研究对象。研究对象纳入标准：2019 年1 月至2020 年8 月，连续纳入符合急性胃肠炎、自愿接受问卷调查的病例。急性胃肠炎患者定义：表现为腹泻（过去24 h 内大便次数超过3 次），并合并腹痛、恶心和呕吐，同时排除已证实患有炎症性肠病、腹泻性乳糜泻、囊性纤维化和食物不耐受的患者。调查信息包括一般人口学信息、临床症状、流行病学史和实验室检查结果。排除标准：基本人口信息不全或者没有粪便标本的病例。采集临床上确诊为急性胃肠炎患者的粪便样本。遵循“先采集，后治疗”的原则。所有粪便样本在实验操作前均进行-80℃低温保存。本研究获得三亚中心医院（海南省第三人民医院）伦理委员会批准（批号：LLKY2311118）。

1.2 病毒核酸提取粪便样本使用TaKaRa Mini-BEST 病毒RNA/DNA 提取试剂盒（No. 9766）进行病毒核酸提取。检测前，使用罗氏一步法逆转录试剂盒（No. 4379012001）将病毒RNA 逆转录为cDNA 备用。

1.3 PeV-A 及其他腹泻病毒检测采用巢式逆转录聚合酶链式反应技术（Nest Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，Nest RT-PCR）扩增高度保守的5′端非翻译区的片段（5′-UTR，243 bp）进行粪便样本中的PeV-A初筛［10］。初筛阳性样本，根据PeV-A 的VP3/VP1 连接区片段（304 bp）进行基因分型。VP1 区则使用改良引物进行扩增（758 bp）。本研究同时检测与致腹泻相关的肠道病毒，包括：A 群轮状病毒、诺如病毒［11］、扎如病毒［12］、腺病毒［13］、人博卡病毒［14］、星状病毒［15］和Salivirus［16］。PCR 产物条带经1%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后在紫外光下观察。

1.4 系统进化分析使用BLAST+2.14.0（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将所有5′-UTR 区及VP1 区核苷酸序列片段与NCBI 网站上的参考序列进行比较。系统进化分析使用MEGA-X（Mega Limited， Auckland， New Zealand）软件进行。使用基于p-距离模型的邻接法构建系统进化树。通过1 000个重复的bootstrap值来评估分支的统计支持度。

1.5 统计学方法分类变量的描述性统计以频率和比例或比率表示，连续变量的描述性统计以中位数和四分位数间距表示。使用Kruskal-Wallis H 检验法进行非参数检验，以比较不同组间连续变量的差异。χ2检验或Fisher 确切概率检验用于比较分类变量的差异。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。所有数据分析均使用SPSS 26.0 版（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）软件进行。

2 结果

2.1 研究对象的人口学特征及临床特征共收集了267 例临床诊断为急性肠胃炎的门诊患者（表1）及其粪便样本。急性胃肠炎患者的中位年龄为3.9岁，5岁以下患者的比例为53.2%（142/267），男女性别比为1.36∶1。患者主要为散居儿童、幼托儿童和学生（66.6%）。

表1 2019-2020 年三亚市某医院急性胃肠炎患者的人口学及临床特征Tab.1 Demographic and Clinical characteristics of Sanya acute gastroenteritis patients between 2019 and 2020例（%）

在临床特征方面，除了腹泻（100%）症状，还有部分患者有恶心（14.6%）、腹痛（27.0%）、腹胀（24.0%）、发热（17.2%）、呕吐（14.2%）和乏力（10.1%）等症状（表1）。粪便特征分析显示，32.6%病例粪便中发现其隐血阳性（表1），3.0%的病例观察到黏液便。

2.2 PeV-A 腹泻患病率及与其他腹泻病毒共感染情况通过巢式RT-PCR 方法，三亚患者粪便标本中PeV-A 核酸的检出率为3.37%（9/267）。绝大多数PeV-A阳性者年龄在2岁以下，尤其是5 ～ 6个月的儿童。男女比例差异无统计学意义（P＞ 0.05）。本研究发现急性胃肠炎全年流行，高峰在12 月至2 月，但与PeV-A 感染相关的季节性分布在夏季和冬季较多（图1）。

图1 2019-2020 年三亚市某医院PeV-A 感染病例的季节分布图Fig.1 Seasonal distribution of PeV-A infections in Sanya，China， 2019-2020

PeV-A 阳性者会出现腹泻、呼吸道感染、恶心、腹痛、呕吐和发烧症状。PeV-A 阳性者的腹泻持续的中位天数为3.0 d，明显高于PeV-A阴性者（P＜0.05）。但PeV-A阳性患者的最高腹泻频率与PeV-A阴性患者相似，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

PeV-A 与A 群轮状病毒（RoV-A）和诺如病毒（NoV）的共感染率分别为11.1%（1/9）和22.2%（2/9）。在呕吐的占比方面，PeV-A阳性组高于阴性组（44.4%vs. 13.2%，P= 0.008）（表2）。

表2 PeV-A 病毒阳性患者与其他不同分组的急性胃肠炎患者的临床症状比较Tab.2 Comparison of clinical symptoms of PeV-A infection between different groups of subjects with acute gastroenteritis例（%）

2.3 PeV-A 基因型的系统发育特征本研究粪便样本中发现了HPeV-1、HPeV-3 和HPeV-5 的VP3/VP1 部分基因序列（图2）。三亚患者的PeV-A基因型大多数为HPeV-1，与国内外的参考株系紧密聚类；其中SY-1943 和SY-1944 与广州的参考株（MK532597、MK532589）相似性达到100%。而SY-1952 株和SY-2195 株分别与兰州的HPeV-3 参考株（JQ715773.1）以及镇江的HPeV-5 参考株（KY067444.1）形成进化分支，相似性分别为98%与93%（图2）。此外，我们进一步对上述序列进行VP1 长片段基因区的扩增与系统进化分析，也得到了类似的结果，即三亚急性胃肠炎患者的PeV-A基因片段可分为3 个不同型别的进化分支；其VP1区的3 个不同基因型片段与来自北京或香港参考株的亲缘关系最为接近，相似性为89% ～ 100%（图3）。

图2 三亚市PeV-A 病毒的VP1/VP3 片段基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed from VP1/VP3 partial gene of Sanya PeV-A

图3 三亚市PeV-A 病毒的VP1 基因系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed from VP1 gene of Sanya PeV-A

3 讨论

PeV-A 在急性胃肠炎患者中的检出率不同地区报告的结果有所不同［17-19］。本研究中三亚的PeV-A 检出率为3.37%，高于在泰国的报道（1.8%或2.4%）［20-21］，但低于CHEN 等［22］在广州地区的研究报道。本研究几乎所有的PeV-A 感染都发生在出生后的第1 ～ 2 年，5 ～ 6 个月龄的婴幼儿感染比例较高，这与之前的研究结果一致［22-25］。在季节分布方面，PeV-A 的流行贯穿全年，虽然大多数研究都观察到PeV-A感染的季节性模式，但高峰季节的差异性很大［26］。本研究中我们发现了PeV-A在三亚地区相对明显的季节性分布，即在夏季和冬季流行，并在7 月份达到高峰，这与泰国和日本的季节分布相似，与陈雪姣等在广州地区的报道也相似［22，25］。

本研究中在三亚地区检测到的PeV-A 基因型主要为HPeV-1、HPeV-3 以及HPeV-5，HPeV-1 检出最多，其次为HPeV-3，与国内外已经发表的报告相似［22，25，27］。本研究还表明，与PeV-A 阴性腹泻患者相比，大部分PeV-A 阳性腹泻患者有更高比例的临床特征：为腹泻、呼吸道感染、恶心、腹痛、呕吐和发烧，提示PeV-A 急性胃肠炎的症状比较明显。但是，由于本研究只有9 例阳性病例，掌握其有关临床特征还需要更大样本量的研究。

综上所述，本研究提供了2019-2020 年间三亚地区急性胃肠炎患者中存在PeV-A 感染的初步流行病学信息，以HPeV-1 基因型为主，其次是HPeV-3 和HPeV-5，病毒阳性者的临床症状也比阴性者重，要引起重视。

【Author contributions】HUANG Liju designed the experiments and wrote the article. LI Yongzhi and HE Huan performed the experiments.SHI Tingli and CHEN Caiyun collected and analyzed data. ZHENG Liting， LIANG Minyi and CHEN Jiaqi revised the article. CHEN Qing designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.