含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2活性的影响

郝礼森,潘恩亮,季景秀,苗笑佳,蒋美钰,王 薇,刘 甜,高莹莹

(华北理工大学附属医院消化内科,河北 唐山 063000)

肝纤维化是肝脏受到损伤后的修复反应,可进展为肝硬化,而肝星状细胞是参与肝纤维化的最重要细胞[1-3]。含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,其过表达可通过增强细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的活性促进肿瘤细胞增殖,参与多种肿瘤的病理过程[4]。近年来研究发现,SHP2除在多种肿瘤的病理过程中发挥重要作用外,也参与了某些非肿瘤性疾病的病理过程。研究发现,在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化病程中,肝组织SHP2表达逐渐升高[5-6];下调体外活化大鼠肝星状细胞SHP2表达可显著抑制其增殖[7]。另有研究[8]发现,ERK1/2信号通路参与了对活化肝星状细胞增殖的调控。目前,SHP2表达变化对纤维化肝组织中ERK1/2的影响尚不清楚。因此,本研究探讨SHP2过表达及低表达对肝纤维化大鼠肝组织中ERK1/2活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠160只,体重350～400 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,质量合格证编号:11501300046788。所有大鼠均按照清洁级要求饲养,自由饮食和进水。实验动物伦理经华北理工大学实验动物伦理委员会审批。

1.2 主要试剂 表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP及靶向SHP2的RNA干扰序列——短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP2由上海汉恒生物科技公司协助构建;兔抗SHP2多克隆抗体(批号:ET1611-35,武汉Abclonal公司);小鼠抗磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)单克隆抗体(批号:16443-1-AP,北京安诺伦生物科技有限公司);小鼠抗ERK1/2单克隆抗体(批号:381050,北京安诺伦生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠肝纤维化模型构建:160只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组和Ad-shRNA/SHP2组,每组32只。将50%四氯化碳橄榄油混合液腹腔注射入模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠,每次1 ml/kg,2次/周,共8周[9]。对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。每周将滴度为2×109pfu/ml的Ad-GFP、Ad-SHP2及Ad-shRNA/SHP2腺病毒自大鼠尾静脉分别注射入Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠[10]。在造模第2、4、6、8周,每组选取8只大鼠取适量肝组织,一部分用于Western blot及实时荧光定量PCR检测,另一部分于4%多聚甲醛固定后用于Masson三色及HE染色和免疫组织化学染色。

1.3.2 HE染色和Masson三色染色:采用HE染色观察大鼠肝组织病理学变化。采用Masson三色染色观察大鼠肝组织胶原沉积。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测SHP2和ERK1 mRNA表达:提取肝组织总RNA,反转录合成cDNA。SHP2、ERK1及内参3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列由赛默飞世尔科技公司合成。其中,SHP2正向引物序列为5’-CTTGGTGAGTGAGTAGAT-3’,反向引物序列为5’-CTTACGGCAGAACATTAG-3’;ERK1正向引物序列为5’-GGCTCACCCTTACCTGGAAC-3’,反向引物序列为5’-GTCCAAAAGGACAGGGGGT-3’;GAPDH正向引物序列为5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’,反向引物序列为5’-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3’。在PCR仪上定量扩增,采用2-ΔΔCt法计算大鼠肝组织SHP2、ERK1 mRNA相对表达量[11]。

1.3.4 免疫组化染色检测SHP2蛋白表达水平:采用SP法进行SHP2免疫组织化学染色,阴性对照用PBS代替一抗,棕褐色为阳性表达。用Image Pro Plus 6.0软件分析染色图像,以积分光密度值 (IOD)表示SHP2阳性表达水平。

1.3.5 Western blot法检测ERK1和p-ERK1蛋白表达:取约100 mg大鼠肝组织剪碎,置于EP管中,加入1 ml改良PIPA裂解缓冲液震荡研匀,提取蛋白。测定蛋白含量后取一定量蛋白,添加适量上样缓冲液,经10% SDS-PAGE凝胶电泳后,用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上,加封闭液4 ℃封闭2 h。分别加入小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶5000稀释)、小鼠抗ERK1/2单克隆抗体(1∶500稀释)和小鼠抗p-ERK1/2单克隆抗体(1∶500稀释),4 ℃过夜。TPBS漂洗后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀释),37 ℃孵育2 h。TPBS漂洗后加入ECL显影液显色成像,采用Image J 图像处理软件分析,ERK1及p-ERK1蛋白表达量用二者的IOD与GAPDH的IOD比值表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝组织病理形态学及胶原沉积变化 见图1。HE及Masson三色染色结果显示,对照组大鼠肝组织无炎症细胞浸润,肝细胞及肝小叶正常,汇管区及小叶间隔有少量纤维沉积,肝小叶中央静脉壁可见纤维染色;模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组以及Ad-shRNA/SHP2组大鼠肝组织随时间延长逐渐出现炎症细胞浸润、细胞变性坏死、正常肝小叶结构消失,甚至出现假小叶,胶原沉积逐渐增加。在同一造模时间点比较,模型组与Ad-GFP组间上述变化无明显差异;与模型组及Ad-GFP组比较,Ad-SHP2组上述病理变化及胶原沉积更明显,而Ad-shRNA/SHP2组减轻。

图1 各组大鼠造模第6周肝组织HE染色及Masson三色染色结果(×400)

2.2 不同造模时间点各组大鼠肝组织SHP2表达变化 见表1、2(图2)。在不同造模时间点(第2、4、6、8周)对各组大鼠肝组织SHP2 mRNA表达及蛋白阳性表达IOD比较,模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组在各造模时间点明显高于对照组(均P<0.05),Ad-GFP组与模型组在各造模时间点比较差异无统计学意义(均P>0.05),Ad-SHP2组在各造模时间点较Ad-GFP组及模型组升高(均P<0.05),而Ad-shRNA/SHP2组在各造模时间点较Ad-GFP组及模型组降低(均P<0.05)。

表1 各组大鼠肝组织不同造模时间点SHP2 mRNA表达比较

表2 各组大鼠肝组织不同造模时间点SHP2蛋白阳性表达IOD比较

2.3 不同造模时间点各组大鼠肝组织ERK1表达变化 见表3、4。在不同造模时间点(第2、4、6、8周)比较,模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组ERK1 mRNA及蛋白表达高于对照组(均P<0.05);但上述四组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表3 各组大鼠肝组织不同造模时间点ERK1 mRNA表达比较

表4 各组大鼠肝组织不同造模时间点ERK1蛋白表达水平比较

2.4 不同造模时间点各组大鼠肝组织p-ERK1蛋白表达变化 见表5(图3)。在不同造模时间点(第2、4、6、8周)对各组大鼠肝组织p-ERK1蛋白表达比较,模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组在各造模时间点高于对照组(均P<0.05),Ad-GFP组与模型组在各造模时间点比较差异无统计学意义(均P>0.05),Ad-SHP2组在各造模时间点较Ad-GFP组及模型组升高(均P<0.05),Ad-shRNA/SHP2组在各造模时间点较Ad-GFP组及模型组降低(均P<0.05)。

表5 各组大鼠肝组织不同造模时间点p-ERK1蛋白表达比较

图3 各组大鼠肝组织p-ERK1蛋白电泳图

3 讨 论

ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员,MAPK/ERK信号通路是一种进化保守的信号级联,在细胞存活、分化、增殖及凋亡的调控中发挥重要作用,其活化可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[12-14]。本研究利用腺病毒载体将靶向SHP2的shRNA及外源性野生型SHP2基因导入四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠,发现SHP2低表达及过表达对大鼠纤维化肝组织中ERK1/2的表达没有影响,但SHP2低表达使大鼠纤维化肝组织中p-ERK1/2的表达下降,而SHP2过表达使p-ERK1/2的表达升高。因为p-ERK1/2为ERK1/2的活化形式,上述结果提示SHP2表达变化影响了大鼠肝纤维化过程中肝组织ERK1/2的活性,即SHP2低表达使大鼠纤维化肝组织中ERK1/2的活性减弱,SHP2过表达使ERK1/2的活性增强。SHP2是由原癌基因编码的具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,其在肿瘤领域的研究[4,15-18]显示,在多种恶性肿瘤如乳腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌组织中过表达,通过增强ERK1/2活性促进肿瘤细胞增殖及抑制肿瘤细胞凋亡参与肿瘤的病理过程,而下调SHP2表达可抑制肿瘤细胞ERK1/2的活性。本研究结果与SHP2在肿瘤领域的研究结果一致,提示肝组织SHP2表达变化可能通过调控ERK1/2的活性影响肝纤维化。

肝纤维化的病理特征是以胶原为主的细胞外基质在肝内的异常沉积。本研究应用Masson三色染色检测了大鼠肝组织胶原沉积的变化,发现SHP2低表达使大鼠肝组织的胶原沉积减轻,而SHP2过表达则加重了大鼠肝组织的胶原沉积。这提示SHP2表达变化可通过调控胶原沉积影响肝纤维化。已有研究[8,19-20]发现,在大鼠肝纤维化病程中,肝组织p-ERK1/2的表达升高,ERK1/2信号通路活性增强,抑制ERK1/2信号通路则可抑制肝星状细胞增殖,促进肝星状细胞凋亡,减轻大鼠肝纤维化。结合本研究中SHP2表达变化对大鼠纤维化肝组织ERK1/2的影响,表明ERK1/2参与了SHP2对肝纤维化的影响,即肝组织中SHP2低表达可通过抑制ERK1/2活性使肝纤维化减轻,SHP2过表达可通过增强ERK1/2活性使肝纤维化加重。肝组织由肝细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞、枯否细胞等多种细胞组成,其中肝细胞是主要细胞,而在肝纤维化病程中发挥重要作用的肝星状细胞仅占约15%[21]。尽管已有研究[7]发现,体外活化大鼠肝星状细胞HSC-T6的SHP2表达下调时细胞增殖明显受到抑制,但SHP2表达变化是通过影响肝脏哪种细胞的ERK1/2信号参与肝纤维化尚需进一步探讨。

综上所述,大鼠肝纤维化组织中SHP2过表达可通过促进ERK1/2磷酸化增强ERK1/2活性,而SHP2低表达则可通过抑制ERK1/2磷酸化降低ERK1/2活性。