不同鱼皮肽抗氧化活性及结构特性的比较

张晓頔，戴志远

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310035 2 河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所 石家庄050035 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连 116000）

近年来，自由基介导的氧化应激和抗氧化剂的研究备受关注[1]。自由基的大量生成会破坏细胞膜、蛋白质和DNA，与机体的衰老和免疫系统的削弱密切相关[2]。抗氧化活性物质可清除体内多余的自由基，防止氧化应激。食品在贮存过程中易发生氧化，导致食品质量下降，因此需要使用抗氧化剂以延长其货架期。而常用的合成抗氧化剂具有潜在毒性，被严格控制使用[2]。亟需寻找安全、无毒的抗氧化活性物质。

2020 年我国水产总产量为6 545 万t[3]，其中副产物占40%～55%。水产品副产物含有大量蛋白质，水解后的多肽具有较高的抗氧化活性，有望成为合成抗氧化剂的安全替代品，已成为近年来制备抗氧化肽的重要原料[4-5]。研究表明，抗氧化肽的肽链通常含有1 个或多个疏水性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基，氨基酸的组成会造成多肽抗氧化活性的差异[5]。尽管国内外对抗氧化活性的多肽进行了大量研究，其结构特性还需进一步研究。

三文鱼刺身、鲟鱼子酱和鳙鱼头是三文鱼、鲟鱼和鳙鱼的主要销售形式，在加工过程中会产生鱼皮等副产物，这些鱼皮的附加值及利用率较低。研究表明，鱼皮多肽具有较高的抗氧化活性[6-7]，而不同鱼皮多肽在抗氧化活性和结构特性上存在一定差异。本研究采用碱性蛋白酶分别水解三文鱼皮、鲟鱼皮和鳙鱼皮，对其水解效果、氨基酸组成和结构特性进行比较，分析它们之间的差异性，并评价鱼皮多肽的抗氧化活性，为提高鱼皮的利用价值提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼皮，悦胜行贸易有限公司；鳙鱼皮，千岛湖海苗森生态食品有限公司；鲟鱼皮，鲟鳇生物科技有限公司；碱性蛋白酶（Alcalase，酶活力为1.2×105U/mg），丹麦Novozymes 公司；菲洛嗪、碳酸酐酶（29 000 u）、细胞色素C（12 400 u）、抑肽酶（6 500 u）和马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL，429 u），美国Sigma 公司；三氯乙酸（TCA）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）、FeCl2和过氧化氢（H2O2）等均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 设备与仪器

数显恒温水浴锅，邦西仪器科技（上海）有限公司；LYNX-4000 高速冷冻离心机、Evolution 60S紫外可见分光光度计，美国Thermo 公司；冷冻干燥机，美国Labconco 公司；Spectra MAX190 酶标仪，美国Molecular Devices 公司；高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；F-4500 荧光分光光度计，日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼皮肽的制备 将新鲜鱼皮切成小块，置于40 ℃干燥箱中烘干，粉碎成粉末后密封保存。经前期试验筛选得到碱性蛋白酶制得的鱼皮多肽抗氧化活性最优，因此本试验选择碱性蛋白酶水解鱼皮。鱼皮粉末与蒸馏水按1∶8（m/V）的比例混匀，调节混合液温度至55 ℃和pH 值至8.0，添加1%的碱性蛋白酶（m/V）。水解过程中连续加入0.1 mol/L NaOH 以维持反应液的最适pH。反应结束后，95 ℃加热10 min 灭活蛋白酶，8 000 r/min离心10 min 后，收集上清液真空冷冻干燥后，计算得率并于-20 ℃保存。

1.3.2 水解度的测定 水解度采用pH-stat 法测定[8]。

1.3.3 TCA-氮溶指数（TCA-NSI）的测定 取20%TCA 将蛋白沉淀，利用BCA 试剂盒测定样品的TCA-NSI[7]。

1.3.4 分子质量的测定 采用高效液相色谱（HPLC）测定抗氧化肽的分子质量[7]。色谱柱为TSK-gel G2000SWxl（7.8 mm×30 mm）；流动相为V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45 ∶55 ∶0.1；流速为0.5 mL/min；检测波长为280 nm；进样量为10 μL。

1.3.5 氨基酸组成的测定 取1.00 g 样品在110℃用6 mol/L HCl 水解22 h，离心过滤后用HPLC测定氨基酸[9]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率 参考Lin 等[10]的方法测定DPPH 自由基清除率。取不同浓度的样品溶液1.5 mL 与DPPH 溶液1 mL（0.02%，m/V，溶于95%乙醇）混匀，室温避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度值。式中，A1——样品的吸光度；A2——95%乙醇与样品反应的吸光度；A3——蒸馏水与DPPH 溶液反应的吸光度。按式（1）计算DPPH 自由基清除率：

1.3.7 ·OH 自由基清除率 参考张晓頔等[7]的方法测定·OH 自由基清除率。

1.3.8 Fe2+螯合活性 参考Lin 等[10]的方法测定Fe2+螯合活性。取0.1 mL 20 mmol/L FeCl2溶液与不同浓度的4.7 mL 样品溶液混匀，室温静置30 min 后，加入0.2 mL 5 mmol/L 菲洛嗪，静置10 min 后于562 nm 波长处测定吸光度值。式中，A1——样品的吸光度值；A2——空白组的吸光度值。按式（2）计算Fe2+螯合活性：

1.3.9 还原力 参考Alavi 等[8]的方法测定还原力。

1.3.10 疏水性的测定 在4 mL 样品溶液（0.3 mg/mL）中加入20 μL ANS（8 mmol/L）作为荧光探针。荧光光谱激发波长为375 nm，发射波长为485 nm，波长范围为380～650 nm，狭缝宽度为5 nm[9]。

1.3.11 荧光发射光谱的扫描 用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）配制成0.2 mg/mL 的样品溶液。荧光光谱激发波长为290 nm，发散光谱扫描范围为300～500 nm，狭缝宽度为5 nm[11]。

1.3.12 傅里叶变换红外光谱（FTIR）的测定 取2 mg 样品加入0.2 g KBr，充分研磨混匀、压片，在4 000～400 cm-1范围内测定FTIR[10]。

1.3.13 Zeta-电位的测定 将样品溶解到50 mmol/L pH 7.0 PBS 中，配成10 mg/mL 的溶液。使用Zeta-电位分析仪测定，测试体积为1 mL，测试温度为25 ℃[12]。

1.4 数据统计与分析

每个处理重复3 次，结果以“平均数±标准差”表示，用SPSS 21.0 统计软件进行方差分析，采用多重比较分析法对各组进行显著性检验（P〈0.05），用Origin 2019b 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同鱼皮肽的水解程度

为评价3 种鱼皮肽的水解效果，在最适的pH和温度条件下水解鱼皮肽4 h，3 种鱼皮肽的水解曲线如图1a 所示。DH 是衡量蛋白质水解程度的重要参数[13]，表示水解物中断裂的肽键占底物中总肽键的百分比[14]。碱性蛋白酶可作用于芳香族或疏水性氨基酸的C 端肽键，是非特异性内切蛋白酶。前期研究表明，碱性蛋白酶为制备鱼皮多肽的最适蛋白酶[7，15]。结果表明，随着水解时间的延长，各鱼皮肽的DH 值呈上升趋势；在3 h 后，DH曲线变得平缓。其中，鲟鱼皮肽具有较高的DH值。水解4 h 后，三文鱼皮肽、鲟鱼皮肽、鳙鱼皮肽的DH 值分别为19.51%，22.34%，20.37%。3 种鱼皮肽的水解趋势与鱼骨蛋白肽[16]和核桃蛋白肽[17]相似。

图1 不同鱼皮肽的DH（a）、TCA-NSI 和得率（b）Fig.1 DH（a），TCA-NSI and yield（b）of different fsh skin peptide

图2 标准品相对分子质量色谱图Fig.2 Chromatogram of relative molecular weight of standard substance

TCA-NSI 也可反映蛋白质的水解情况，TCANSI 越高表明多肽得率越高。水解程度会影响水解物的分子质量、氨基酸组成、结构特性和生物活性[18-19]。3 种鱼皮肽水解4 h 后的TCA-NSI 和得率如图1b 所示。3 种鱼皮肽的TCA-NSI 之间存在显著性差异（P〈0.05）。鲟鱼皮肽的TCA-NSI 值最高（48.65%），其次是鳙鱼皮肽（45.41%）和三文鱼皮肽（40.98%）。与其它鱼皮肽相比，鲟鱼皮肽的得率最高（70.36%）。对DH 和TCA-NSI 进行相关性分析发现，3 种鱼皮肽中DH 与TCA-NSI 均呈正相关。

2.2 不同鱼皮肽的分子质量分布

图1 为标准品相对分子质量色谱图，根据其对数与Kav值作曲线，得到标准曲线方程为y=-0.2099x+7.0174（R2=0.9907），说明线性关系良好。由表1 可知，3 种鱼皮肽分子质量分布表现出一定的差异，小分子肽（180～3 000 u）含量为鲟鱼皮肽〉鳙鱼皮〉三文鱼皮肽，表明鲟鱼皮肽水解更为彻底。本研究表明，鱼多肽分子质量分布与DH值呈负相关，这与Zhang 等[15]和Alavi 等[8]的研究结果一致。此外，Wu 等[2]发现，分子质量〈3 000 u的多肽具有较好的抗氧化活性，分子质量大小与抗氧化活性呈负相关。本研究制备的鲟鱼皮肽具有较低的分子质量，推测其可能具有较高的抗氧化活性。

表1 不同鱼皮肽的分子质量Table 1 Molecular weight of different fish skin peptides

2.3 不同鱼皮肽的氨基酸组成

不同鱼皮肽的氨基酸组成如表2 所示。鲟鱼皮肽的总氨基酸含量最高（82.44 g/100 g），其次是鳙鱼皮肽（78.14 g/100 g）和三文鱼皮肽（77.44 g/100 g）。三文鱼皮肽、鲟鱼皮肽和鳙鱼皮肽的酸性氨基酸（Glu 和Asp）分别占总氨基酸的15.98%，16.50%，15.5%，碱性氨基酸（Arg、Lys、His）分别占总氨基酸的11.41%，11.78%，11.31%，疏水性氨基酸（Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met 和Pro）分别占总氨基酸的26.74%，30.73%，31.30%。多肽中的疏水性氨基酸可清除自由基，与抗氧化活性相关[20]，水解过程中疏水性氨基酸C 末端的肽键断裂，裂解后疏水性氨基酸处于新肽链的端基，可发挥其抗氧化效果[21]。His 的咪唑环可螯合金属离子，进而抑制由金属离子催化产生的氧化反应，使多肽具有良好的抗氧化活性[20]；Trp 可将质子提供给缺少电子的自由基，从而使自由基淬灭[22]；Gly 是强抗氧化剂谷胱甘肽的重要组成氨基酸，同时也是3 种鱼皮肽含量最多的氨基酸。此外，短链多肽C端的Leu 也可增强其抗氧化活性[21]。综上所述，不同鱼皮肽的氨基酸含量和组成有所差异，鱼皮肽的氨基酸组成与抗氧化活性有关。

表2 不同鱼皮肽氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of different fish skin peptides

2.4 不同鱼皮肽抗氧化肽活性的比较

以DPPH 自由基清除率、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和还原力评价多肽的抗氧化活性。不同抗氧化试验的作用机制有所不同。DPPH 自由基遇到抗氧化剂时，会与含氢供体的抗氧化剂结合，结合强度可反映抗氧化活性的强弱[10]；·OH 的化学性质极其活跃，易与氨基酸、蛋白质、DNA 等生物分子发生反应，一旦与物质接触，可在瞬间发生反应[5]；过渡金属离子引发活性氧的产生，加速脂质过氧化连锁反应，抗氧化剂对其螯合作用会延缓氧化反应[20]；还原力可表征抗氧化剂提供电子的能力，是评价抗氧化活性的重要指标[23]。

不同质量浓度（1.0～8.0 mg/mL）鱼皮肽的抗氧化活性如图3 所示。抗氧化试验结果表明，鱼皮肽的DPPH、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和还原力均呈浓度依赖性，这一结果与之前的报道一致[7，23]。虽然3 种鱼皮肽均具有一定的抗氧化活性，但对比3 种鱼皮肽发现，不同质量浓度下鲟鱼皮肽的抗氧化活性显著高于三文鱼皮肽和鳙鱼皮肽（P〈0.05）。胡晓等[5]研究表明，一定范围内罗非鱼酶解肽的抗氧化活性随水解程度的增加而增加，对其活性组分氨基酸含量进行鉴定发现，Trp、Gly 和His 为其含量较高的氨基酸，抗氧化活性可能与水解过程中多肽链的长度和氨基酸排列有关，本试验也证明了这一观点。水解之后，鱼皮蛋白表面暴露了更多的非特异性蛋白组分，这些组分在二级结构中的α-螺旋和β-折叠中，可将Fe3+还原成Fe2+。鱼皮肽还原力的不同与氨基酸侧链基团中暴露的电子密度有关，电子密度起着极性或电荷部分的作用[6]。一般来说，多肽的抗氧化活性不仅与原料和蛋白质的一级结构有关，也与芳香族或疏水性氨基酸残基的含量相关[24]。

图3 不同质量浓度下不同鱼皮肽的抗氧化活性比较Fig.3 Comparison of antioxidant activity of different fish skin peptides at different concentrations

2.5 不同鱼皮肽结构特性的对比

2.5.1 疏水性分析 疏水性可表示蛋白质的疏水基团含量，是反映蛋白质分子结构的重要指标之一[25]。Wani 等[26]研究表明，多肽疏水性的差异主要取决于疏水性氨基酸的含量，这在抗氧化活性中起重要作用。不同鱼皮肽的表面疏水性如图4 所示。结果表明，鲟鱼皮肽（431）和鳙鱼皮肽（427）的表面疏水性显著高于三文鱼皮肽（387）（P 〈0.05），鲟鱼皮肽和鳙鱼皮肽中有较多的疏水性氨基酸，这与之前氨基酸分析结果一致。Noman 等[25]表明，疏水性与蛋白质的空间构象和暴露的氨基酸残基有关。在水解过程中，蛋白酶对埋藏的疏水区进行了高特异性的切割，使蛋白分子内部的疏水基团释放出来[27]。

图4 不同鱼皮肽的疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of different fish skin peptides

2.5.2 荧光发射光谱分析 在蛋白质氨基酸中，Trp 具有荧光特性，且Trp 残基对微环境的变化很敏感，其荧光强度可表征蛋白质的三级结构[28]。Trp残基的特征峰为λ＝360 nm，荧光光谱峰位、峰强的改变都反映了色氨酸所处环境的变化。不同鱼皮肽的荧光光谱如图5 所示。三文鱼皮肽、鲟鱼皮肽和鳙 鱼皮肽 的λmax分别为354.5，355.4，355.6 nm，3 种鱼皮肽的荧光光谱峰位无显著差异（P〉0.05）。3 种鱼皮肽的λmax均在360 nm 附近，说明Trp 残基位于蛋白质分子外部的极性环境中[29]。此外，在λ 最大值时，鲟鱼皮肽荧光强度（357.2）〉鳙鱼皮肽荧光强度（307.1）〉三文鱼皮荧光强度（214.5）。结果表明，鱼皮肽的荧光强度与水解度呈正相关。水解程度越大，鱼皮蛋白会暴露出越多的Trp 残基，这与氨基酸分析结果相一致，这对多肽的抗氧化活性有着积极作用。不同荧光基团的活性部位、肽类和暴露氨基酸的变化不同，导致荧光峰强度和λmax值不同[29]。

图5 不同鱼皮肽的荧光光谱、λmax 和荧光强度Fig.5 Fluorescence spectroscopic，λmax and fluorescence intensity of different fish skin peptides

2.5.3 FTIR 分析 FTIR 可表征大分子中官能团的振动和蛋白质的二级结构，波数的变化显示了分子结构的变化，信号强度可代表相关官能团的浓度[30]。由图6 可看出，鱼皮肽的光谱相当复杂，包含许多不同官能团贡献的谱带，3 种鱼皮肽在4 000～400 cm-1范围内具有相似的吸收模式。3 种鱼皮肽在3 500～3 000 cm-1之间存在较强吸收峰，表明多肽分子内形成了C=O-N-H 的氢键[31]，且氢键含量为鳙鱼皮肽〉鲟鱼皮肽〉三文鱼皮肽。3 000～2 800 cm-1的吸收峰与CH3和CH2的伸缩振动相关，这种伸缩振动通常发生在蛋白质的脂肪族侧链中[18]，其中峰值位于2 924 cm-1和2 850 cm-1的振动吸收分别属于CH2的对称和非对称拉伸振动[19]。同时，图中SBPHs 的酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1）信号较强，这与C=O 键和肽键的C-N 伸缩振动有关，其峰型受蛋白质二级结构的影响[32]。这些结果表明，不同鱼皮肽的内部微环境和疏水区有一定差异。

图6 不同鱼皮肽的FTIR 谱图Fig.6 FTIR spectra of different fish skin peptides

在FTIR 谱图中，酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）与C=O 键和肽键的C-N 伸缩振动有关，可反映蛋白质的二级结构[11]。图6 中鱼皮抗氧化肽的酰胺Ⅰ带信号较强，其峰形受蛋白质二级结构的影响。利用Omnic 8.2 软件和Peakfit 4.21 软件得到高斯曲线拟合图，根据各子峰峰面积计算鱼皮肽二级结构的含量（表3）。各子峰与蛋白质二级结构归属关系为：1 664～1 646 cm-1为α-螺旋特征峰；1 700～1 682 cm-1和1 637～1 615 cm-1为β-折叠特征峰；1 681～1 664 cm-1为β-转角特征峰；1 645～1 637 cm-1为无规卷曲特征峰[18]。α-螺旋结构是有序结构，易发生构象变化；β-折叠和β-转角结构属于相对伸展的有序结构，而无规卷曲结构是无序结构[9]。对比各二级结构含量发现鱼皮肽中β-折叠结构的含量最高（34.14%～41.04%），无规卷曲结构含量最低（10.61%～11.80%），与已有报道一致[9]。前期研究表明，水解会使鱼皮蛋白的二级结构由α-螺旋和β-折叠转变为β-转角，鱼皮的有序结构被破坏，蛋白分子变得柔韧疏松[23]。鳙鱼皮肽中α-螺旋结构含量较高，三文鱼皮和鳙鱼皮肽的α-螺旋含量分别为24.41%和22.89%。α-螺旋是蛋白质二级结构中最稳定的。鲟鱼皮和鳙鱼皮肽中β-折叠较低，表明蛋白质疏水相关位点暴露，暴露的疏水性氨基酸可促进多肽清除自由基的相关位点，进而提升抗多肽的抗氧化活性[11]。

表3 不同鱼皮肽二级结构的含量Table 3 Estimated secondary structures of different fish skin peptides

2.5.4 Zeta-电位 蛋白质的Zeta-电位可表示溶液中蛋白分子的静电相互作用，反映溶液的稳定性[30]，其大小与带电基团和氨基酸残基的分布有关[33]。由图7 可知，3 种鱼皮肽的Zeta-电位均为负值，说明蛋白分子表面带有大量负电荷，静电斥力使颗粒散落分布而不易发生聚集[34]。鲟鱼皮肽的Zeta-电位绝对值显著高于鳙鱼皮肽和三文鱼皮肽（P〈0.05），可能是因为水解过程释放的带负电荷氨基酸多于带正电荷的氨基酸所致。

图7 不同鱼皮肽的Zeta-电位Fig.7 Zeta-potential of different fish skin peptides

3 结论

研究表明，不同鱼皮肽的氨基酸组成、蛋白质构象和微环境体系有一定的差异，造成其抗氧化活性有所差异。水解程度较高的鲟鱼皮肽具有最高的抗氧化活性，同时鲟鱼皮肽具有较高的荧光强度、疏水性和较低的Zeta-电位，表明其疏水性氨基酸含量较高。通过酶解技术挖掘了鱼皮抗氧化肽，提升了鱼皮副产物的应用价值和营养价值，可为水产源蛋白质加工深层次利用提供理论依据。随着鱼皮肽抗氧化活性研究的深入，下一步应对多肽-食物相互作用对其抗氧化活性和生物利用率展开研究。