海参肽的抗氧化稳定性及对细胞氧化损伤的保护作用

王倩倩，杜 鹃，冯凤琴*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 杭州康源食品科技有限公司 杭州 310003）

一般情况下，体内的自由基（细胞代谢的中间产物）是不断产生的，以维持活性氧正常的代谢平衡[1-2]。然而，过多的自由基会攻击细胞的不饱和脂肪酸和蛋白质，引起脂质、蛋白质和DNA 等大分子的氧化，从而诱导细胞凋亡。大量研究表明：癌症、阿尔茨海默症、2 型糖尿病和心血管疾病等慢性疾病都与体内活性氧含量的增加有关[3-4]。因此，有必要寻求能够维持体内自由基代谢平衡的外源性抗氧化剂来改善人体生理机能，从而达到预防慢性疾病的目的。目前，通过蛋白水解从食物蛋白制备的生物活性肽包括谷物类[5]、蔬菜类[6]、蛋类[7]、坚果类[8]、奶类[9]、鱼类[10]等被证明具有显著的抗氧化活性。与化学合成的抗氧化化合物相比，食物来源的抗氧化肽无不良副作用。另外，抗氧化肽不仅在体外和细胞模型中具有清除自由基和脂质氧化抑制的活性，而且还可改善活性氧介导的包括小鼠和果蝇在内的氧化应激损伤[11-12]。

海参（Holothurians），棘皮动物门海参纲动物，可能早在寒武纪时期就出现了。在世界范围内已知约有50 种海参可被食用，其中以海参、刺参和梅花参为主要属。自古以来，海参因具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗凝血、抗疲劳和抗衰老等促进健康的功效而用于医药行业[13-14]。海参体壁中含有丰富的蛋白质（约80%～90%），是制作海参肽的良好来源，且已被证明具有良好的体外和体内抗氧化活性[15-16]。目前关于海参肽的研究主要集中在制备工艺、分离纯化及生物活性等方面，而有关加工、储藏条件对其活性的影响研究较少[17-18]。本文通过研究不同水解度海参肽（SCP-L 和SCP-H）在不同环境因素（温度、pH、食品配料、金属离子、模拟胃肠液消化）条件下对海参肽抗氧化稳定性的影响，评估其对H2O2诱导L929 细胞氧化应激损伤的保护作用，以期为海参肽的实际应用提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同水解度的海参肽（低水解度DH=27.73%，SCP-L；高水解度DH=33.57%，SCP-H）由杭州康源食品科技有限公司提供。

小鼠成纤维细胞L929 购于中科院上海细胞库，培养基为含有胎牛血清（10%）和双抗（1%）的RPMI1640，培养条件为37 ℃，5%CO2。

胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640 培养基、双抗、0.25%胰酶，上海源培生物科技股份有限公司；LDH、SOD、GSH-Px和MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

BSA224S 电子分析天平、PB-10 pH 计，赛多利斯科学仪器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；Infinite M200 Pro 酶标仪，瑞士帝肯集团公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；HC-3018R 高速冷冻离心机，安徽中佳科学仪器有限公司；MCO-170AICUVDL-PC CO2细胞培养箱，日本松下电器产业株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 体外抗氧化活性

1）DPPH 自由基清除率[19]在离心管中依次加入200 μL 海参肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）和400 μL DPPH 溶液（0.05 mmol/L），混匀后置于室温下避光反应0.5 h，于517 nm 波长处测定其吸光值。同时做样品对照和空白对照，并通过公式（1）计算：

2）羟自由基清除率[20]在离心管中依次加入200 μL 硫酸亚铁溶液（9 mmol/L）、200 μL 水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L）、200 μL 海参肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）和200 μL H2O2（0.03%），混匀后置于37 ℃水浴锅中反应0.5 h，于510 nm波长处测定其吸光值。同时做样品对照和空白对照，并通过公式（2）计算：

3）ABTS 自由基清除率[21]0.5 mL ABTS 溶液（7 mmol/L）与0.5 mL K2S2O8（2.45 mmol/L）混合均匀，室温避光保存16 h 后使用。然后用蒸馏水稀释至734 nm 波长处吸光度为0.7±0.02。取100 μL 的海参肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）与100 μL 的ABTS 工作液混匀，避光反应10 min，于734 nm 波长处测定吸光度。同时做空白对照，并通过公式（3）计算：

1.3.2 环境稳定性

1）温度 将海参肽溶液（15 mg/mL）分别置于20，40，60，80，100 ℃的水浴锅中水浴1 h，冷却至室温后，测定其·OH 清除率。

2）pH 分别用盐酸和氢氧化钠将海参肽溶液（15 mg/mL）的pH 值调节至3，5，7，9，11，在室温下放置1 h，测定其·OH 清除率。

3）食品配料 在海参肽溶液（15 mg/mL）中分别添加5%的氯化钠、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖，在室温下放置1 h，测定其·OH 清除率。

4）金属离子 在海参肽溶液（15 mg/mL）中分别添 加500 μg/mL 的KCl，CaCl2，MgCl2，ZnCl2和CuCl2，在室温下放置1 h，测定其·OH 清除率。

5）胃肠道蛋白酶[22]胃消化阶段：将海参肽按照1∶10（g/mL）的比例加入到胃蛋白酶液中，置于37 ℃水浴锅中模拟胃消化1 h。灭酶后冷冻干燥以获得模拟胃消化阶段的海参肽。胃肠消化阶段：将胃消化阶段的海参肽灭酶后，用NaHCO3（0.9 mol/L）溶液将pH 值提高到5.3，并进一步用氢氧化钠（1 mol/L）将pH 值调节至6.8，然后同样按照1∶10（g/mL）的比例加入到胰蛋白酶液中，并将混合物置于37 ℃中模拟肠消化2 h。消化完成后将混合液置于沸水浴中加热10 min 以灭酶活，然后将其冷冻干燥以获得模拟胃肠消化的海参肽。最后将获得胃和胃肠消化阶段的海参肽配制成质量浓度为15 mg/mL 的溶液，分别测定其·OH清除率。

1.3.3 海参肽对L929 细胞损伤的保护作用

1.3.3.1 海参肽对L929 细胞生长的影响 参照王倩倩等[23]的方法培养L929 细胞，并计算细胞的存活率。其中海参肽的质量浓度分别为0，0.2，0.4，0.8，1.6 mg/mL。

1.3.3.2 海参肽对L929 细胞损伤的保护作用 参照王倩倩等[23]的方法培养L929 细胞，构建H2O2诱导细胞氧化损伤模型，并计算细胞的存活率。其中海参肽的质量浓度 分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL。

1.3.3.3 抗氧化指标测定 将细胞按照1×105个/孔的密度接种到6 孔板中，然后按照1.3.3.2 节描述的步骤处理后，收集细胞和培养液。分别测定上清液中LDH 活力和细胞内SOD 活力、GSH-Px 活力和MDA 含量。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 26.0 进行统计学处理，结果表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 抗氧化稳定性

2.1.1 体外抗氧化方法和海参肽浓度筛选 为了筛选出海参肽的体外抗氧化效果最优的评价方法和最佳质量浓度，比较了3 种体外化学评价方法，分析了不同质量浓度的影响。由图1 可知，当质量浓度在5～30 mg/mL 范围内时，SCP-L 和SCP-H的上述3 种体外抗氧化能力均随着质量浓度的增加而增加。在3 种体外抗氧化评价方法中，SCPL 的半抑制质量浓度分别为56.48，19.58，11.58 mg/mL，SCP-H 的半抑制质量浓度分别为46.97，18.40，9.89 mg/mL，得出海参肽对羟自由基清除能力效果最好，故选择该试验方法作为后续评价不同环境因素对海参肽氧化稳定性影响的评价指标。就该方法而言，海参肽质量浓度在5～15 mg/mL 范围内时，羟自由基清除率有较大变化，在15 mg/mL 时，分别达到了67.83%和74.05%，此后随着质量浓度的增加，清除率逐渐增加，而增加不显著。因此，选择海参肽质量浓度15 mg/mL 进行后续试验。

图1 不同水解度海参肽的体外抗氧化活性Fig.1 The antioxidant activity in vitro of SCP-L and SCP-H

值得注意的是，在上述3 种体外抗氧化评价方法中，当两种海参肽的质量浓度相同时，SCP-H的体外抗氧化活性均高于SCP-L。分子质量较小的生物活性肽可以更有效地与自由基相互作用，更容易通过肠道屏障，从而在体内发挥抗氧化活性[24]。根据前期研究结果，SCP-H 分子质量在2 000 u 以下的肽段含量为98.39%（〈1 000 u 的部分占90.12%），而SCP-L 的为87.89%（〈1 000 u的部分占68.13%）。另外，生物活性肽中的一些氨基酸如极性氨基酸（半胱氨酸、组氨酸和酪氨酸）和疏水性氨基酸（蛋氨酸和色氨酸）可以作为氢供体或受体以形成不同强度的氢键，发挥一定的抗氧化活性[25]。酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸等氨基酸可作为氢供体；天冬氨酸和谷氨酸等酸性氨基酸能螯合金属离子；丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等疏水氨基酸可能有助于改善肽在脂质相的溶解度，促进肽与脂质自由基的相互作用，从而提高抗氧化活性[26]。研究发现在与抗氧化相关的氨基酸组成上，两者是没有任何区别的（SCP-L 的极性氨基酸和疏水性氨基酸为60.42%，SCP-H 的极性氨基酸和疏水性氨基酸为60.46%）。因此，SCP-H 的体外抗氧化效果优于SCP-L，可能是由于其分子质量不同导致的。

2.1.2 不同环境条件对海参肽抗氧化稳定性的影响 由图2a 可知，在20～100 ℃范围内，加热1 h后SCP-L 和SCP-H 的羟自由基清除率几乎没有变化，这与姚秩俊等[27]的研究结果相反。姚秩俊等[27]研究发现，当温度超过60 ℃时，菜籽肽的DPPH 自由基清除率急剧下降，温度为100 ℃时，其亚铁离子螯合能力仅有30%左右（室温时为85%左右）。然而，吴兴美等[28]的研究结果与本研究类似，他们发现蚕丝素蛋白肽在90 ℃下放置2 h后，仍然具有较高的抗氧化活性（保留原来的90%～93%）。综合以上研究结果发现海参肽具有良好的热稳定性。

图2 温度、pH、食品配料、金属离子和胃肠消化对海参肽抗氧化稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature，pH，food ingredients，and metal ions on the antioxidant stability of SCP-L and SCP-H

由图2b 可知，与正常条件下的海参肽溶液的清除率相比，在pH 值为5 时，SCP-L 和SCP-H 的羟自由基清除率也无明显变化，pH 值为3 和7时，自由基清除率SCP-L 分别下降了34.67%，18.69%，SCP-H 分别下降了17.65%，6.86%。在碱性条件下（pH 值为9 和12），SCP-L 和SCP-H 的羟自由基清除能力均完全丧失。出现这种情况可能有两方面的原因，一方面可能是由于强碱环境使得肽分子结构发生消旋作用，肽链构象发生了改变，从而影响了其生物活性的表达[29]，另外一方面可能是因为在碱性环境下作为肽清除自由基的氢供体上的氢被消耗，从而导致其抗氧化活性降低[30]。综合以上研究结果发现海参肽适用于制造偏酸性的产品，应尽量避免在碱性强的环境下加工使用。

由图2c 可知，分别在SCP-L 和SCP-H 中添加5%的不同食品配料，发现葡萄糖、淀粉、乳糖和蔗糖对其羟自由基清除能力均无明显变化，而添加氯化钠后，其羟自由基清除率显著降低了13.02%和12.12%，这与刘丹[31]的研究结果相一致。综合以上研究结果发现海参肽应尽量避免在含有氯化钠的环境下。

由图2d 可知，分别在SCP-L 和SCP-H 中添加500 μg/mL 的 金属离子发 现，K+、Ca2+、Mg2+对SCP-L 和SCP-H 的羟自由基清除率无明显影响。当添加Cu2+后，羟自由基清除率分别下降了7.32%和11.64%。同样地，Zn2+的加入也使得羟自由基清除率下降了28.12%和29.86%，表明海参肽对Cu2+和Zn2+较敏感，这两种金属离子可能与海参肽之间存在特殊的化学力作用，进而使得其抗氧化活性降低，这与裴云成等[32]的研究结果一致。综合以上研究结果发现海参肽应尽量避免在含有Cu2+和Zn2+的环境。

由图2e 可知，经模拟胃液消化后的SCP-L和SCP-H 对羟自由基清除活性分别降低了4.58%和5.340%，而经过模拟胃肠液消化后的清除率分别显著增加了41.88%和31.80%。这可能是由于海参肽在经过胃蛋白的作用后，使得原来具有抗氧化活性的部分肽段水解成了单个的氨基酸残基，进而导致其抗氧化能力丧失。但经过胰蛋白的作用后又使得具有抗氧化活性的基团被释放出来。因此，海参肽在模拟胃肠液消化条件下的抗氧化稳定性大于模拟胃液，可适用于制成口服的功能性食品中。

2.2 海参肽对H2O2 诱导L929 细胞氧化损伤的保护作用

2.2.1 海参肽对L929 细胞的毒性作用及其对H2O2诱导的细胞损伤的保护作用 基于体外的化学评价方法得知SCP-L 和SCP-H 均具有较强的清除自由基能力。而氧化应激是由于过量的自由基积累而导致的一种应激反应，它会使得健康的细胞发生损伤和凋亡。因此，接下来测定了细胞水平上的抗氧化活性。为了确定海参肽作用于L929细胞的安全浓度范围，将不同浓度的SCP-L 和SCP-H 分别加入到细胞培养基中，培养24 h 来检测其对L929 细胞存活率的影响。由图3a 可知，与正常组相比，无论是SCP-L 还是SCP-H，在0.2～0.8 mg/mL 时能够促进细胞增殖，SCP-L 细胞存活率分别达到了102.31%，116.57%，103.25%，SCP-H 细胞存活率达到了113.47%，128.60%，111.12%。当质量浓度为1.6 mg/mL 时，抑制了细胞的增殖，存活率分别为90.88%和96.84%，表明海参肽质量浓度为1.6 mg/mL 时，显示出对L929细胞的毒性作用。结果表明，0.2～0.8 mg/mL 的SCP-L 和SCP-H 对L929 细胞均无毒性，且SCPH 的效果优于SCP-L。因此，选取0.2～0.8 mg/mL的两种海参肽进行后续试验。

图3 海参肽对L929 细胞存活率的影响Fig.3 Effect of SCP-L and SCP-H on the viability of L929 cells

由图3b 可知，与模型组相比，在0.2～0.8 mg/mL 质量浓度范围内的SCP-L 均能显著提高细胞存活率；与模型组相比，0.6 mg/mL 时的两种海参肽组的细胞存活率提高了52.10%（P 〈 0.001）；SCP-H 与SCP-L 对细胞的氧化损伤的保护作用的结果相似，然而当质量浓度为0.4 mg/mL 时，对细胞的保护作用最显著（显著提高了75.32%）。综合以上结果表明SCP-L 和SCP-H 质量浓度为0.2～0.6 mg/mL 时，对L929 细胞的氧化损伤的保护作用均较好，且SCP-H 的效果优于SCP-L，因此选取0.2，0.4，0.6 mg/mL 的两种海参肽进行后续试验。

2.2.2 海参肽对L929 细胞损伤的抗氧化能力的影响 LDH 广泛存在于各个组织的胞浆内，当细胞受损时便会由细胞内渗透至细胞外[33]。由图4a可知，与模型组相比，SCP-L 的质量浓度为0.2～0.6 mg/mL 时，LDH 活力分别减少了6.19%，17.87%，20.67%（P 〈 0.05）；同样地，SCP-H 的LDH 活力相应减少了13.22%，22.61%，25.91%（P〈0.01）。当机体处于臭氧、氮氧化物、高氧等环境时，可能会促使生物膜的多不饱和脂肪酸脂质发生过氧化，进而促进MDA 等脂质过氧化物的产生[34]。由图4b 可知，0.2，0.4，0.6 mg/mL 的SCP-L使得细胞内的MDA 含量降低0.24%，16.37%（P〈0.05）和26.39%（P 〈 0.01），同时，SCP-H 使得MDA 含量分别降低了21.65%（P 〈 0.01），41.14%和44.36%（P〈0.001）。

图4 海参肽对H2O2 诱导L929 细胞抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of SCP-L and SCP-H on the antioxidant activity in L929 cells induced by H2O2

SOD 作为各种器官组织中自由基的“头号杀手”，能够将超氧自由基转化为H2O2。GSH-Px 能够使有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，同时促进H2O2分解成H2O 和O2，保护细胞形态[35]。由图4c 可知，与模型组相比，SCP-L 质量浓度为0.2，0.4，0.6 mg/mL 时，SOD 活力分别提高了30.62%，73.86%，89.63%（P〈0.01）；同时SCP-H使得SOD 活力分别显著提高了65.02%，122.58%（P〈0.01）和130.17%（P〈0.001）。类似地，SCP-L的GSH-Px 活力相应提高了10.37%，35.37%（P〈0.05）和26.22%，SCP-H 的GSH-Px 活力也相应提高了23.76%，41.94%，40.14%（P〈0.05）。

综合以上试验结果发现SCP-L 和SCP-H 均可以通过降低细胞膜的通透性和细胞的脂质过氧化程度，以及提高细胞的抗氧化酶活力，在一定程度上减弱H2O2诱导的L929 细胞氧化损伤，且SCP-H 的效果优于SCP-L。

3 结论

抗氧化稳定性研究表明SCP-L 和SCP-H 均具有良好的热稳定性，当在海参肽中添加葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、K+、Ca2+、Mg2+对其抗氧化活性均无显著影响；当添加氯化钠、Cu2+、Zn2+以及在碱性环境下显著降低了其抗氧化稳定性；模拟胃液会降低其抗氧化活性，而模拟胃肠液则明显提高了其抗氧化活性。因此，海参肽在储存过程中应尽量避免与强酸、强碱、含氯化钠、Cu2+和Zn2+等环境因素接触。海参肽对H2O2诱导L929 细胞氧化损伤的保护作用结果表明，SCP-L 和SCP-H 通过降低上清液中LDH 活力、细胞内MDA 含量以及提高SOD 和GSH-Px 活力，实现对氧化应激损伤L929细胞起到良好的保护作用，且SCP-H 的效果优于SCP-L。本研究可为海参肽在后期的实际应用提供一定的理论基础。