香糟大黄鱼的红酒糟中优势菌生长动力学研究

张秀洁，郭全友，杨 絮，郑 尧，郑昇阳，李 丹

（1 宁德师范学院生命科学学院 福建宁德352100 2 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 3 上海海洋大学食品学院 上海 201306）

大黄鱼（Pseudoshian crocea）俗称黄花鱼、黄瓜鱼等，2022 年全国养殖产量约25.8 万t，其中福建省产量约为21.5 万t，为我国东南沿海重要经济鱼类[1-2]。发酵是使鱼类产生特殊风味的一种重要的加工方式[3-4]。随着社会经济的发展，发酵的技术与方法不断得到改进[5-6]。世界各地发酵鱼类丰富多样[7]，其中香糟大黄鱼为福建省特色。以新鲜大黄鱼和提前发酵完毕的红酒糟为原料，经密闭发酵后形成的一种醇香浓郁，风味独特的发酵制品。

发酵过程中辅料的加入、原料本身携带和加工时进入的微生物等均可对发酵制品的菌系组成造成影响[8-9]。红酒糟大黄鱼传统生产工艺中以红酒糟为原料，其中含有的微生物是发酵体系中微生物的主要来源。在不同发酵条件（NaCl、pH、Aw、温度等）下，菌种经短暂的停滞期后，以适当的速度发挥良好的发酵性能[10]。刘璐等[11]从贵州黔东南地区具有饮食文化特色的鱼酱酸中分离出多株具有产γ-氨基丁酸能力的乳酸菌，其中植物乳杆菌Y279 和Y64 具有较高的产GABA 能力，同时也显现出良好的耐酸、耐胆盐、生长速率及产酸速率快等发酵性能。Zeng 等[12]在传统低盐发酵酸鱼中共分离并筛选得到5 株表现出较强的益生菌性状和理化性质的酵母菌，通过评估对pH、温度、盐浓度的耐受性以及测定其蛋白水解、脂解活性，以此筛选性能较好的酿酒酵母菌株来制作发酵剂，提高传统发酵酸鱼质量。Khusro 等[13]在印度传统发酵鱼Ngari 中分离得到对病原体具有较强拮抗活性的腐生葡萄球菌，除具有高酸性耐受性外，该菌株表现出明显的疏水性。梁慧等[14]从湖北传统腊鱼中分离筛选得到季也蒙毕赤酵母和近平滑假丝酵母，对它们进行耐盐性、亚硝酸盐耐受性、耐酸性等发酵适应性试验，有望将其开发成为新型肉品发酵剂。

在实验室前期研究的基础上[15]，本研究以短乳杆菌和酿酒酵母为对象，研究其生长动力学等，以期为香糟大黄鱼产业工业化生产及产品质量提高提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

在实验室前期研究中，经分离纯化和BIOLOG 鉴定后，采用16S rDNA 测序确认酿酒酵母和短乳杆菌为红酒糟中的优势菌，其比例分别为41.74%和55.28%[15]。新鲜大黄鱼购自福建省宁德市某公司，层冰层鱼方式放入泡沫箱，冷链运至上海，备用。

MRS 培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，北京陆桥技术股份有限公司；MRS Borth，北京索莱宝科技有限公司；YPD Borth，青岛海博生物技术有限公司；微孔板，芬兰Bioscreen 公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；乳酸（食品级），郑州高研生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen 公司；ZHWY-200H 恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaCl 和pH 对乳酸菌生长的影响 根据发酵食品中菌株所需的耐受性，NaCl 质量分数梯度设置为2%，4%，6%，8%，用HCl 调节pH 值，pH值梯度设置为3，4，5，6，7，根据上述条件配制相应MRS 接种液，121 ℃灭菌15 min，即为无菌接种液。Bioscreen 微孔板中每孔加入180 μL 无菌接种液体，同时取约104CFU/mL 浓度的新鲜培养菌悬液20 μL 接种至微孔板中，每个梯度5 组平行，无菌MRS Borth 作为对照。将微孔板放入Bioscreen微生物生长测定仪中中速振荡，每1 h 测定其OD600nm值，30 ℃共培养5 d。

1.3.2 NaCl、pH 和乳酸对酵母菌生长的影响 根据发酵食品中菌株所需的耐受性，NaCl 质量分数梯度设置为2%，4%，6%，8%，10%，用HCl 调节pH 值至3，4，5，6，7，乳酸质量分数梯度设置为1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%；根据上述条件配制相应YPD 接种液，121 ℃灭菌15 min，即为无菌接种液。取配制好的无菌接种液，Bioscreen 微孔板中每孔加入180 μL 无菌接种液体，同时取约104CFU/mL 浓度的新鲜培养菌悬液20 μL 接种至微孔板中，每个梯度5 组平行，无菌PDA Borth 作为对照。将微孔板放入Bioscreen 微生物生长测定仪中中速振荡，每1 h 测定其OD600nm值，30 ℃共培养5 d。

1.3.3 菌株生长动力学建模与评价 模型构建：采用修正的Gompertz 模型进行数据拟合[16]，见式（1）。

式中，t——时 间（h）；Nt——t 时间对应的OD600nm值；Nmax——最大的OD600nm值；N0——初 始OD600nm值；μmax——最大比生长速率（h-1）；Lag——延滞期（h）。

模型评价：采用判定系数R2，均方误差（RMSE），偏差因子（Bf）和准确因子（Af）[17]计算模型的拟合优度，其中R2、Af和Bf值越接近于1，RMSE 越接近于0，表明预测效果越好，评价方程如下。

式中，yobs——实测值；ycal——预测值；n——实测值个数。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 进行数据处理及计算，并采用Origin 9.0（美国OriginLab 公司）进行Gompertz模型拟合。

2 结果与分析

2.1 短乳杆菌生长动力学

短乳杆菌可产生具有拮抗或杀死致病菌的细菌素等物质[18]，并具有益生特性，常从传统发酵食品中分离得到并被用作发酵食品的发酵菌株或辅助发酵剂[19-20]。图1 和图2 分别为NaCl 和pH 对短乳杆菌生长的影响，表1、表2 分别为NaCl 和pH 对短乳杆菌生长动力学参数的影响。可见短乳杆菌生长曲线呈“S”型持续增长趋势，模型评价中R2均〉0.99，Af在1.000～1.100 之间，Bf在0.990～1.040 之间，RSME 在0.000～0.100 之间，生长模型拟合优度良好。

表1 不同NaCl 条件下短乳杆菌生长动力学参数Table 1 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria under different NaCl conditions

表2 不同pH 值下短乳杆菌生长动力学参数Table 2 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria under different pH values

图1 NaCl 对短乳杆菌生长的影响Fig.1 Effects of NaCl on the growth of Lactobacillus brevis

图2 pH 对短乳杆菌生长的影响Fig.2 Effect of pH on the growth of Lactobacillus brevis

由图1 及表1 可知，当NaCl 质量分数在2%～6%范围内时，短乳杆菌能够生长；当增加至8%时，短乳杆菌在120 h 内OD 值无显著差异（OD值≤0.05），判定为不生长。30 ℃条件下，μmax随NaCl 质量分数增大而减小，未添加NaCl 时，μmax为0.022 h-1，Lag 为12.3 h，当NaCl 质量分数增加至6%时，μmax降至0.008 h-1，Lag 增加至27.9 h，此时短乳杆菌虽然生长受到抑制，但其仍能生长。食盐是加工过程中是必不可少的一种辅料，不仅对腐败微生物具有抑制作用，并可促进发酵制品良好质构和滋味的形成[21]。根据该菌的耐盐特性，在提倡减盐理念的当下，可作为强化低盐发酵鱼制品的优良菌种[22]。

由图2 及表2 可知，当pH 值为3 时，此时μmax为0.003 h-1，Lag 为48.1 h；当pH 值增加至6时，此时μmax最大，Lag 最短，分别为0.019 h-1，11.7 h；当pH 值增加至7 时，μmax下降，Lag 增加，其Nmax达到最大值。以上表示pH 值在3～7 范围内，短乳杆菌均能生长，表现出良好的耐酸能力，当pH 值为6 时短乳杆菌生长速率最大，能更好的启动发酵。

2.2 酿酒酵母生长动力学

酿酒酵母在发酵制品中对风味的形成具有重要作用[23]，也通常是发酵制品体系中的优势菌株[24]。图3、图4 和图5 分别为NaCl、pH 和乳酸对酿酒酵母生长的影响，表3、表4、表5 分别为NaCl、pH 和乳酸对酿酒酵母生长动力学参数的影响。模型评价中R2均〉0.98，Af在1.000～1.100 之间，Bf在0.980～1.000 之间，RSME 在0.000～0.005 之间，表明生长模型拟合优度良好。

表3 不同NaCl 条件下对酿酒酵母生长动力学的影响Table 3 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different NaCl conditions

表4 不同pH 值对酿酒酵母生长动力学的影响Table 4 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different pH values

表5 不同乳酸条件下对酿酒酵母生长动力学的影响Table 5 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different lactic acid conditions

图3 NaCl 对酿酒酵母生长的影响Fig.3 Effects of NaCl on the growth of Saccharomyces cerevisiae

图4 pH 对酿酒酵母生长的影响Fig.4 Effects of pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae

图5 乳酸对酿酒酵母生长的影响Fig.5 Effect of lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae

由图3 可知，在NaCl 质量分数2%～10%范围内，酿酒酵母均能生长，随着NaCl 质量分数的增大，生长逐渐受到抑制。当NaCl 质量分数为6%时，μmax为0.024 h-1，Lag 为27.5 h，在10%NaCl 质量分数下经过延滞期之后仍能生长，即酿酒酵母表现出良好的食盐耐受性。酵母菌通常与乳酸菌协同发酵，故酵母菌需能够适应酸性环境并有较好的状态使发酵持续进行[8]。由图4 可知，酿酒酵母对酸碱度不敏感，pH 值在3～7 范围内，酿酒酵母生长状况良好；除pH 值为3 时，其μmax和Lag均无显著差异（P〈0.05）；当pH 值为6 时，其μmax值与pH 值为7 时相近，然而其Lag 值略小于pH值为7 时的Lag 值；pH 值为7 时，其有最大Nmax值，表明酿酒酵母生长速率优于中性条件，在酸性条件下迟滞期小于中性条件，此酿酒酵母具有嗜酸的特点。由图5 可知，在乳酸质量分数在1%～6%范围内，随着乳酸添加量的增加，酿酒酵母的生长逐渐受到抑制。当乳酸质量分数为1%时，此时μmax为0.088 h-1，Lag 为6.8 h，相比未添加乳酸条件下的酿酒酵母的生长，μmax增大，Lag 降低；在乳酸质量分数由1%～4%范围内时，酿酒酵母生长受到明显抑制。乳酸质量分数为7%时，120 h 内OD 值无显著差异（OD 值≤0.05），判定为不生长。Zeng 等[12]对酿酒酵母的耐受性测试中，设定乳酸质量分数为0.6%～1.2%。在本研究中当乳酸质量分数增大至4%时，对酿酒酵母才有明显的抑制作用，在经过延滞期后酿酒酵母仍能正常生长。在乳酸质量分数为1%条件下，表现出对酿酒酵母生长的促进作用，此时有最大的生长速率和最短的延滞期，已有学者研究表明乳酸菌和酵母菌之间存在互作关系，上清液能促进或者抑制彼此生长[25-27]，关于在本研究中分离自红酒糟的酿酒酵母与短乳杆菌混合培养体系中两者的相互作用还需进一步研究。

3 结论

本文以源自福建特产糟制大黄鱼发酵原料红酒糟中的优势菌短乳杆菌和酿酒酵母为研究对象，测定不同环境因子下优势菌株生长曲线，分析对两株菌动力学参数的影响，并使用Gompertz 模型评估优势菌株耐受性。结果表明：在模型评价中，生长模型拟合优度良好。短乳杆菌具有6%（质量分数）NaCl 的耐受性，在减盐的趋势下，短乳杆菌满足对食盐耐受性的要求；此外短乳杆菌具有良好的耐酸能力，在pH 值为6 时，生长速率最高，能更好的启动发酵。在对酿酒酵母生长特性分析中发现，酿酒酵母对各环境因子均具有较强的耐受性，具体表现为在10%（质量分数）NaCl 条件下，虽经过了较长的延滞期，但其仍能够生长，在1%～6%（质量分数）NaCl 条件下生长良好；酿酒酵母在pH 3～7 条件下，各梯度生长无明显差别，具有较短的延滞期，故在发酵中能够不受体系pH值的影响，更好的启动发酵；在不同质量分数乳酸条件下，低浓度乳酸条件下生长无较大差异，在质量分数6%条件下才有较明显的抑制作用，对不同环境因子下的短乳杆菌和酿酒酵母生长动力学的影响，可为实际生产提供参考。