羊肚菌液体发酵培养基的优化及发酵产物抗氧化活性研究

刘倩，李 正，欧佳琪，黄 文，2，王 益，刘 莹，2*

（1 华中农业大学食品科学技术学院 武汉430070 2 果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室 武汉 430070）

羊肚菌（Morchella esculenta）作为一种珍贵的药食两用真菌，其性质平和、味甘寒、没有毒性[1]。羊肚菌中含有多糖、多酚等多种活性成分，具有防止氧化、抵御肿瘤生长、缓解疲劳等作用[2]。目前对羊肚菌活性成分的研究中，羊肚菌多糖作为含量最为丰富的物质被广泛研究[3]，而对羊肚菌多酚的研究较少，且主要集中在羊肚菌子实体[4]或菌丝体[5]中多酚的提取工艺。

液体发酵技术就是在反应器中模拟自然界的环境[6]，向其中加入供菌种生长繁殖的营养物质，通过搅拌或振荡等手段调节外部条件，使菌体在反应器中生长繁殖，获得目标物质[7]。这种方法不仅可以提高菌丝体及其发酵产物的产量，还可以保证产品品质的标准化[8]。优化液体发酵的方法可以从培养基添加物质、发酵条件等方面入手，使目标产物含量提高[9]。目前有关于羊肚菌液体发酵的相关报道中，有通过优化发酵条件提高发酵液中多糖含量的研究，如Meng 等[10]通过优化羊肚菌的液体发酵培养基以及工艺参数，得到发酵液的胞外多糖含量为（2 913±265）mg/L。Li 等[11]以羊肚菌胞外多糖含量为指标，利用豆腐渣发酵羊肚菌，最终得到多糖含量为（95.82±1.37）mg/g。此外，也有研究测定发酵产物中的多酚含量，如金红等[12]测定金针菇等8 种食用菌发酵液中的总酚含量，结果发现，总酚含量最高的是金针菇，可达5.07 mg/100 mL，然而目前未见通过优化羊肚菌液体发酵条件提高发酵液中多酚含量的相关报道。

针对羊肚菌发酵液中多酚含量较低的问题，本研究通过单因素实验和Box-Behnken 响应面法优化液体发酵培养基中的碳源、氮源和无机盐添加量，提高发酵产物中的多酚含量，并测定所得发酵产物的抗氧化活性，为羊肚菌发酵液中多酚的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肚菌株为M4M26 梯棱羊肚菌，保存于CYM 培养基上，来自华中农业大学应用真菌研究所；土豆淀粉（食品级），河北古松农副产品有限公司；大豆蛋白、乳清粉、蛋黄粉、食品级葡萄糖、蔗糖均为食品级，河南万邦实业有限公司；黄豆粉（食品级），曲靖市晨骏商贸有限公司；紫薯粉（食品级），广州福正东海食品有限公司。

试剂：蛋白胨、酵母浸粉均为分析级，安琪酵母股份有限公司；福林酚（分析级），上海源叶生物科技有限公司；琼脂（分析级），广州赛国生物科技有限公司；没食子酸（分析级），阿拉丁生化科技股份有限公司；MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、葡萄糖、无水碳酸钠、甲醇均为分析级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1550 酶标仪，Thermo scientific 公司；SW-CJ-2FDG 超净工作台，莱特（南通）有限公司；HZQF160 全温振荡摇床，苏州培英实验设备有限公司；LGJ-10 真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 羊肚菌种子液的制备及处理 CYM 培养基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g、琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 自然，121 ℃高温、高压灭菌30 min。

种子培养基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g，蒸馏水1 L，121 ℃高温、高压灭菌30 min。

发酵培养基：食品级葡萄糖2 g，大豆蛋白1 g，KH2PO40.5 g，加蒸馏水至100 mL，在高压灭菌锅内121 ℃，30 min 灭菌后备用。

将保存于试管中的M4M26 梯棱羊肚菌（以下简称羊肚菌）接种至CYM 平板上，待菌丝体生长5 d 后，取直径1 cm 的菌块24 个，接入种子培养基中，置于全温振荡培养箱中培养4 d，设置转速为120 r/min，温度25 ℃。摇瓶振荡4 d 后取出，在超净工作台上将种子培养基和菌球进行匀浆，制成羊肚菌种子液，按10%接种量接入发酵培养基中进行发酵。

将发酵完成的羊肚菌发酵液匀浆后，在80 ℃水浴锅中加热30 min，使菌丝体中的活性物质浸出后，离心、过滤得到澄清的羊肚菌发酵液，浓缩后冻干获得粉末状样品，用于后续测定。

1.3.2 单因素实验

1）碳源单因素实验 以土豆淀粉、紫薯粉、蔗糖代替1.3.1 节中发酵培养基中的葡萄糖，其它添加物质与1.3.1 节发酵培养基保持一致。试验条件：温度25 ℃、摇床转速120 r/min、发酵7 d，以多酚含量为指标确定最佳碳源。对最佳碳源的添加量进行单因素实验。

2）氮源单因素实验 在发酵培养基基础上选用黄豆粉、乳清粉、蛋黄粉代替大豆蛋白作为氮源，其它成分保持不变。试验条件与1.3.2（1）节一致。之后对最佳氮源添加量进行单因素实验。

3）无机盐单因素实验 赵航轲等[13]的研究表明，在选取的8 种无机盐中，以KH2PO4为唯一无机盐时得到的菌丝体最多。本试验直接选用KH2PO4作为无机盐供给，对其添加量进行单因素实验，试验条件与1.3.2（1）节一致，以多酚含量为指标确定最优添加量。

4）响应面分析法优化发酵培养基 基于单因素实验筛选的各种添加物，用Design-Expert 12软件，以发酵后的多酚含量作为优化指标进行条件优化。响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.3 多酚含量的测定方法及表示 采用Folin-Ciocalteus 法测定多酚含量[14]，在10 mL 离心管中加入1 mL 待测样品，5 mL 蒸馏水，3 mL 的7.5%碳酸钠溶和1 mL 福林酚试剂，在室温避光处反应2 h，取200 μL 加入96 孔板中，用酶标仪于765 nm 波长下测定吸光度，以没食子酸（0，5，10，15，25，30 μg/mL）为对照品绘制标准曲线。

本节试验中待测样品为羊肚菌菌丝体发酵液经冷冻干燥后得到的固体粉末，用蒸馏水配制成0.50 mg/mL 的待测溶液。发酵液中多酚含量计算公式如下：

式中，X——发酵液中的多酚含量（mg/mL）；ρ——以样品反应体系吸光度及没食子酸标准曲线计算得出（mg/mL）；c——待测样品的溶液质量浓度，0.50 mg/mL；m——发酵液冻干粉的质量（mg）；V——发酵液体积（mL）。

1.3.4 抗氧化活性的测定方法

1）DPPH 自由基清除率的测定方法 参考Zeng 等[15]的方法并加以调整。用甲醇溶解DPPH配成0.2 mmol/L 的溶液（使用时配制），避光放置。以酶标孔为反应容器，取一定浓度的样液100 μL于酶标孔中，加等量的DPPH 溶液，充分混合，室温下避光静置反应10 min，在517 nm 波长处测定吸光值Ai。用甲醇代替DPPH 溶液测得吸光值为Aj，用蒸馏水代替样品测得吸光值为A0。清除率计算公式如下：

2）ABTS 自由基清除率测定方法

①ABTS 溶液的配制 配制7.0 mmol/L ABTS 溶液和140.0 mmol/L K2S2O8溶液，分别取5 mL 和88 μL 完全混匀，避光保存14 h。试验前用蒸馏水稀释，734 nm 波长处的吸光度在0.698～0.702 之间即可使用。

②试验方法 以酶标孔为反应容器，吸取一定浓度的样液20 μL 于酶标孔中，加入180 μL ABTS 自由基溶液，室温避光反应10 min，在734 nm 波长处测定其吸光度值Ai。用蒸馏水代替ABTS 自由基溶液测得吸光度值Aj，用蒸馏水代替样品测得吸光度值A0。清除率计算公式同1.3.4节。

3）羟自由基清除率的测定方法 参考Nicholas 等[16]的方法并加以调整。以酶标孔为反应容器，吸取一定浓度的样液50 μL 于酶标孔中，依次加入FeSO4溶液（9.0 mmol/L）和水杨酸乙醇溶液（9.0 mmol/L）50 μL，完全混匀后加入50 μL H2O2（8.8 mmol/L）溶液，37 ℃反应60 min。反应结束后在510 nm 波长处测定其吸光度值Ai。用蒸馏水代替H2O2溶液测得吸光度值Aj，用蒸馏水代替样品测得吸光度值A0。清除率计算公式同1.3.4节。

4）FRAP 铁离子还原能力的测定

①FRAP 工作液的配制 将0.3 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=3.6），0.01 mol/L TPTZ 溶液和0.02 mol/L FeCl3溶液分别取10，1，1 mL，混合均匀，开始使用时配制。其中TPTZ 用0.04 mol/L 盐酸溶解，两者充分混合。

②制作标准曲线 以酶标孔为反应容器，在其中加入10 μL 不同浓度的FeSO4溶液，再加入190 μL FRAP 工作液，在37 ℃反应15 min。结束后在593 nm 波长处测吸光度值Ai。用蒸馏水代替FRAP 工作液测得吸光度值Aj，用蒸馏水代替样品测得吸光度值A0。以Ai-A0-Aj值为纵坐标，对应的FeSO4溶液浓度为横坐标作图。

③测定FRAP 值 按照制作标准曲线的方法，将FeSO4溶液换成发酵液样品，其余操作一致，得到Ai-A0-Aj值，将其带入标准曲线中，确定相应的FeSO4浓度，即FRAP 值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 培养基碳源和氮源种类对多酚含量的影响

从图1 可看出，不同碳源和氮源对发酵液中多酚含量的影响差异显著，其中最佳碳源为土豆淀粉，最佳氮源为大豆蛋白。因此，选取这两种物质作为发酵培养基的碳源和氮源。

图1 不同碳源（a）、氮源（b）、无机盐（c）种类对发酵液中多酚含量的影响Fig.1 Effects of different carbon（a），nitrogen（b）and inorganic salt（c）species on polyphenol content in fermentation broth

据王莹[17]的研究结果，淀粉作为碳源时所得菌丝体生物量最少，仅为葡萄糖的2/3；刘华晶等[18]的研究也证明了这一点。而本试验以土豆淀粉为碳源时，得到的发酵液中多酚含量最高。推测是菌丝发酵过程中，如果菌丝体的生物量超过一定限度，就会开始利用多酚，从而使发酵产物中多酚含量减少[19]。

李文静[20]对羊肚菌深层发酵培养基的研究表明，羊肚菌在无机氮源中的生物量不如在有机氮源中的生物量高。赵航轲等[13]研究表明将有机氮源黄豆粉添加至发酵培养基时，得到的菌丝体生物量最多。而本试验中，用大豆蛋白作为氮源时，发酵液中多酚含量最高，分析大豆蛋白和黄豆粉的成分，大豆蛋白中蛋白质含量可达90%以上，分解后有利于菌丝体合成蛋白质和核酸[21-22]，可以供给菌丝体生长足够的营养，有利于菌丝体发酵产物的生成。

2.1.2 各物质添加量对多酚含量的影响 由图2a可知，随着土豆淀粉添加量的增加，发酵液中的多酚含量呈先增加后降低的趋势，且土豆淀粉添加量为0.5%时，发酵液中多酚含量达到最大值。土豆淀粉添加量在0～0.25%时，发酵液中多酚含量增长缓慢，而添加量0.25%～0.5%时迅速增加，说明当土豆淀粉添加量小于0.25%时，土豆淀粉作为碳源，不足以提供羊肚菌菌丝体生长发育所需营养，不利于发酵产物的积累。随着土豆淀粉添加量的增大，羊肚菌菌丝体生长发育所需的营养物质逐渐充足，使其发酵产物的多酚含量达到最大值。然而，当土豆淀粉添加量继续增大时，菌丝体的生长发育迅速增长，当土豆淀粉供给的营养不足以支撑菌丝体生长发育所需时，便开始消耗发酵液中的多酚，使其含量大幅度下降。最终选择土豆淀粉添加量为0.5%。

图2 培养基各物质添加量和发酵液中多酚含量的关系Fig.2 The relationship between the added amount of each substance in the medium and the content of polyphenols

由图2b 可知，随着大豆蛋白添加量的增加，发酵液中的多酚含量呈现先增加后降低的趋势，当大豆蛋白添加量为4%时，发酵液中多酚含量达到最大值。大豆蛋白添加量在1%～4%时，发酵液中多酚含量不断增大，添加量4%～8%时逐渐降低，说明其添加量小于4%时，随着供给羊肚菌菌丝体生长发育的营养的增加，其发酵产物多酚含量达到最大值。而在发酵培养基水溶液保持100 mL 不变时，大豆蛋白添加量越多，发酵培养基溶液的黏稠度越大，在同样摇床转速下，培养基的振荡幅度相对减小，不利于气体的流动，溶解氧减少[23-24]，使菌丝体生长缓慢，不利于发酵产物的生成，因此发酵液中多酚含量开始下降。最终选择大豆蛋白添加量为4%。

由图2c 可知，增大KH2PO4的添加量，发酵液中的多酚含量先增多后减少，当KH2PO4添加量为0.25%时，多酚含量达到最大值。KH2PO4添加量在0～0.25% 时，多酚含量不断增加，这是因为无机盐在液体发酵过程中起到调节渗透压和氧化-还原电位的作用，添加少量的无机盐可促进菌丝体和发酵产物的生成[25-26]。然而继续增加无机盐浓度，可能使培养基浓度过高，从而抑制菌丝体的生长[18]。最终选择KH2PO4的添加量为0.25%。

2.2 响应面法分析优化发酵培养基提高发酵液中多酚含量

响应面试验设计是通过对上述单因素实验中的3 个因素：土豆淀粉添加量、大豆蛋白添加量和磷酸二氢钾添加量，进行排列组合得出，见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 模型建立和显著性分析结果 使用软件对表2 进行拟合，结果见表3。回归方程为：

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

多酚含量=1.04+0.0124A+0.0170B-0.1137C-0.0675AB +0.0034AC +0.0511BC -0.2185A2-0.2210B2-0.2388C2，回归模型的方差分析见表3。

由表3 可看出，模型的P=0.0351〈0.05（显著），失拟项检验的P=0.9395（不显著），R2=0.8448，其中R2用于反映回归方程对响应值的拟合效果[27]，意味着此次模拟可以解释84.48%的情况，表明模型充分拟合试验数据[28]。该方程是发酵液中多酚含量与培养基各物质添加量适合的数学模型，可利用其确定提高发酵液中多酚含量的培养基物质添加量。在试验范围，不同因素对发酵液中多酚含量的影响排序为C〉B〉A，即KH2PO4〉大豆蛋白〉土豆淀粉添加量。

2.2.2 响应面结果分析 响应面的3D 图形是响应值对各因素所构成的三维空间曲面图，可看出各因素水平的最优解及其之间的影响[29]。曲面越陡，表明该因素对响应值的影响越大[30]。从图3 可看出，KH2PO4添加量的响应面坡面比较陡峭，说明其对多酚含量影响较大，而土豆淀粉和大豆蛋白的响应面坡面较平缓，说明其对发酵液中多酚含量的影响不是很大，这与表3 的回归分析结果一致。

图3 两因素交互作用对多酚含量的响应面Fig.3 Response surface of two-factor interaction on polyphenol content

2.2.3 最佳工艺验证 通过软件分析得到最优结果为土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氢钾0.3%，在此条件下由公式计算出的多酚含量理论值为1.06 mg/mL。以最优结果为基础，进行3 组验证试验，3 组发酵液中多酚平均含量为1.02 mg/mL，测定结果与理论值的相对误差为3.3%，表明试验结果合理、可靠。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由图4 可看出，在1～5 mg/mL 范围内，发酵液对DPPH 自由基的清除效果与浓度变化一致，基本呈直线，表明发酵液对DPPH 自由基有很好的清除作用。根据拟合得到的线性方程计算发酵液的IC50=1.83 mg/mL，与李文静[20]得到的羊肚菌发酵液DPPH 自由基清除率的IC50（约6 mg/mL）相比，本样品的DPPH 自由基清除效果更好。

图4 VC 和发酵液样品对DPPH 自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on DPPH

2.3.2 ABTS 自由基清除能力 由图5 可以看出，随着发酵液浓度的增大，对ABTS 自由基的清除效果变好，当质量浓度大于10 mg/mL 时，清除效果没有明显变化，维持在60%左右，达到清除极限。根据拟合曲线计算得到的IC50=4.81 mg/mL，相比于猴头菌发酵液[31]的IC50=68 mg/mL，羊肚菌发酵液的ABTS 自由基清除率效果优于此猴头菌发酵液。

2.3.3 羟自由基清除能力 从图6 可以看出，VC和发酵液质量浓度与其对羟自由基清除能力的变化一致。计算VC 的IC50=0.1 mg/mL，而发酵液质量浓度为3 mg/mL，对羟自由基的清除能力达80%左右，且不再有明显升高，达到清除极限。计算其IC50=0.78 mg/mL，是维生素C 的70%左右，表明羊肚菌发酵液具有较强的羟自由基清除效果。

2.3.4 FRAP 铁离子还原能力分析 由图7 可以看出，随着发酵液浓度的升高，对铁离子的还原能力也升高，发酵液质量浓度达15 mg/mL 时，FRAP值基本保持在0.8 左右，到达饱和。相比李文静[20]的羊肚菌发酵液质量浓度25 mg/mL 时的FRAP值0.75，本试验得到的发酵液效果更好。

图7 VC 和发酵液样品对铁离子还原能力的测定Fig.7 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on FRAP

3 结论

本研究通过改变发酵培养基中的添加物质及其添加量来调控羊肚菌发酵液中的多酚含量，是从发酵源头进行调控，便于工厂生产，且发酵原料来源广泛、价格便宜，无毒性，得到的多酚更加安全。在单因素实验的基础上，通过响应面法分析得出培养基各物质的最佳添加量，其中土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氢钾0.3%。对最佳条件下得到的羊肚菌发酵液进行活性测定，发现其具有较好的抗氧化活性，符合多酚具有较好抗氧化活性的特征。其多酚结构还有待进一步研究。