响应面优化QuEChERS-液相色谱串联质谱法分析茶饮料中合成着色剂＊

韦志超，于喆源，杨 博，彭 东

（甘肃省张掖市质量检验检测研究院，甘肃 张掖 734000）

食用色素是以改善食品色泽为目的的重要食品添加剂，由于该类添加剂具有色泽鲜艳、着色力强、易于调色、性质稳定以及成本低廉等优势，在食品加工中被广泛使用[1-3]。食用色素其专业名称为食用合成着色剂，是一种非营养成分，多以煤焦油中提炼出的苯胺染料为原料研制而成，含有R-N=N-R键、苯环或氧杂蒽等结构[4-7]。为了防止滥用合成着色剂，世界各国都通过立法严格控制食物中人工合成着色剂的用量[8-10]。我国现行标准《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[11]中对可以作为食品添加剂使用的合成着色剂品种、应用范围以及最高限量均有具体规定。

茶文化在中国拥有悠久的历史和丰富的内涵，茶饮料作为一种饮用便捷，同时兼具传统茶叶提神解渴功效的饮品，越来越受到消费者的青睐。其含有的茶多酚、黄酮等诸多生理活性物质，有抗氧化、抗癌、降低血糖血压、防治心血管疾病以及抗衰老等多种保健功能[12-13]。市场上部分商人为了追求利益，提高产品的卖相，超范围在茶饮料中添加合成着色剂，尤其在深受年轻群体欢迎的奶茶类和果茶类饮料更是此类问题的频发地带。

目前对人工合成着色剂的检测方法主要采用聚酰胺吸附法[14-15]，利用聚酰胺的化学性质，在酸性环境下吸附合成着色剂，在碱性环境下解吸合成着色剂。此纯化过程步骤繁琐、操作费时，对于含有大量蛋白质、脂肪等成分的奶茶样品，合成着色剂提取率较低[16]，同时相关标准方法采用254 nm波长检测，测定时易受样品基质的干扰[17]。QuEChERS作为一种新的前处理方法，具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全的特点，其原理是利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的[18-20]。因此，为了提高茶饮料中人工合成着色剂分析效率，本研究尝试采用Box-Benhnken 设计响应面法，采用常见5种合成着色剂平均回收率为表征指标，通过优化QuEChERS前处理方法中十八烷基键合硅胶（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）及提取剂pH[21-23]，确定针对茶饮料检测的最佳方案，以期建立一种经济高效的茶饮料中合成着色剂的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），成都科隆；乙酸（分析纯）、乙酸铵（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水（分析纯），无水乙醇（分析纯），上海国药集团；柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝，均为标准品（100 μg/mL），First Standard公司；C18、PSA填料，上海麦克林；实验用水为密理博纯水系统（美国）制得的超纯水。

样品：市售茶饮料。

1.2 仪器与设备

1290-6460液相色谱-串联质谱仪，美国安捷伦公司；GL323-2SCN型千分之一天平，美国赛多利斯公司；HN-30AL超声清洗机，上海汉诺公司；MV5高通量平行浓缩仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；Milli-Q型超纯水器，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别吸取上述5种合成着色剂标准溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，制成含上述合成着色剂1 μg/mL的标准品中间液；吸取中间液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，用超纯水定容至10 mL，制成浓度分别为20、40、80、100、200、500 ng/mL的标准工作液。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；进样量3 μL；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min。流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。

电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；扫描方式：多重反应监测（MRM）；干燥气温度：300 ℃；去溶气流速：11 L/min；池出口电压:4 kV；去簇电压:100 V；碰撞气：高纯氮气（99.999%）。5种合成着色剂的质谱参数见表2。

表2 5种合成着色剂定性、定量离子对和质谱分析参数

1.3.3 样品的处理

称取10 g样品于50 mL离心管中，加入25 mL无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超声10 min，4000 r/min离心10 min，继续添加上述提取剂至40 mL。取上清液10 mL置于另一50 mL离心管中，调节pH至中性，加入吸附剂PSA 100 mg和C18 300 mg，涡旋2 min，4000 r/min离心15 min，取10 mL上清液置于蒸发皿中，蒸至近干，用水定容至2 mL，溶液经0.22 μm滤膜过滤后待用。

1.3.4 单因素试验

（1）C18用量对合成着色剂提取率的影响

在PSA添加量为100 mg，pH为7.0的条件下，考察不同C18添加量对平均回收率的影响。

（2）PSA用量对合成着色剂提取率的影响

在C18添加量为400 mg，pH为7.0的条件下，考察不同PSA添加量对平均回收率的影响。

（3）提取液pH对成着色剂提取率的影响

在PSA添加量为100 mg，C18添加量为400 mg的情况下，考察不同提取剂pH对平均回收率的影响。

1.3.5 响应面试验

根据单因素试验结果的分析，选取C18用量、PSA用量、提取液pH三种因素为变量，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，以5种合成着色剂平均回收率为响应值，通过建立响应面，试验因素水平见表3。

表3 响应面试验因素水平

1.3.6 平均回收率的测定

在空白样品中分别加入2 mL的1 μg/mL混合标准中间液，使样品中的添加量为50 ng/mL。按照“1.3”的方法处理样品并测定其每种合成着色剂的含量，并计算平均回收率。平均回收率公式如下：

式中：Ci为每种合成着色剂的测量浓度；N为合成着色剂的种类数。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，结果使用平均值±标准差的形式表示，应用Microsoft office Excel 2007与Design Expert 8.0软件进行响应面试验统计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

按“1.3.4 单因素试验”项下要求，按“1.3 方法”项下相关要求，分别考察不同C18、PSA添加量和提取剂pH对合成着色剂平均回收率的影响。具体设计见表4。

表4 单因素试验设计

2.1.1 C18添加量的确定

按“1.3.4 单因素试验”项下要求，在PSA添加量为100 mg，pH为7.0的条件下，分别按“表4”所示，选取不同C18添加量进行提取净化操作，结果如图1所示。

图1 C18添加量对合成着色剂平均回收率的影响

由图1可见，随着添加C18量的增加，合成着色剂平均回收率也不同，呈现先增大后减小并保持的趋势。C18是目前QuEChERS法使用最多的一种吸附剂，对非极性化合物有较强吸附作用，常被用来去除极性溶液中的非极性化合物，对样品中油脂等杂质有较好的吸附效果，可以减少脂溶性杂质对检测的干扰。但当C18添加量达到500 mg时，合成着色剂回收率呈下降趋势。因此，在实际试验中，选取400 mg添加量为C18添加量的中心值。

2.1.2 PSA添加量的确定

按“1.3.4 单因素试验”项下要求，在C18添加量为400 mg，pH为7.0的条件下，分别按“表4”所示，选取不同PSA添加量进行提取净化操作，结果如图2所示。

图2 PSA添加量对合成着色剂平均回收率的影响

由图2可见，随着PSA添加量的增加，合成着色剂平均回收率呈现先上升后保持的趋势。PSA通过氨基的弱离子交换作用和极性基质成分形成氢键，从而吸附和消除样品基质中的糖类、天然合成着色剂以及脂肪酸。茶饮料中普遍含有糖和天然合成着色剂，通过添加PSA进行吸附可以较好地去除该类杂质，当用量达到120 mg时，合成着色剂平均回收率达到最高。因此，在实际试验中，选取120 mg添加量为PSA添加量的中心值。

2.1.3 提取剂pH的确定

按“1.3.4 单因素试验”项下要求，在PSA添加量为100 mg，C18添加量为400 mg的条件下，分别按“表4”所示，选取不同提取剂pH进行提取净化操作，结果如图3所示。

图3 pH对合成着色剂平均回收率的影响

由图3可见，待净化提取液pH对合成着色剂回收率有较为明显的影响，在pH为4.0～7.0时，随着pH的增加，回收率明显增加；在pH达到7.0时，达到最大回收率；在pH为7.0～8.0时，回收率虽然下降，但下降程度较小，但pH在超过8.0时，回收率明显下降，尤其是当pH为9.0时，合成着色剂平均回收率仅为21.7%。根据各吸附剂性质，中性及酸性环境下，被测合成着色剂在吸附剂中吸附较弱，随着提取剂的碱化，合成着色剂呈现解离状态，在吸附剂上的吸附增强，平均回收率降低。因此，在实际试验中，选择pH等于7.0为中心值。

2.2 响应面设计及结果

根据单因素试验结果的分析，选取C18用量、PSA用量、提取液pH三种因素为变量，按“1.3.5 响应面试验”中各个水平，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，以5种合成着色剂平均回收率为响应值，进行试验。

采用Design-Expert8.0软件，按照Box-Behnken组合设计[24-26]，试验结果见表5，并进行回归模型显著性检验及方差分析，结果见表6。

表5 响应面试验设计及结果

表6 显著性检验及方差分析

2.2.1 响应曲面分析

采用Design-Expert 8.0软件对响应值与各因素编码值进行回归拟合后得到合成着色剂平均回收率与各变量的二次多项式方程模型为：R=0.94+0.014×A+0.031×B+0.38×C-0.035×AB+0.017×AC-0.008×BC-0.044×A2-0.009×B2-0.35×C2。

表6可以看出，方差分析说明，该响应面分析模型拟合度良好，失拟项P=0.308 3＞0.05不显著；模型的均方差P<0.000 1，表明回归模型极显著；同时从决定系数（R2=0.998 7）和校正系数（R2=0.996 3）得出，选定的因素与响应值之间存在较高的相关性，模型可以用来解释和预测响应值，预测值具有较高的可信度；变异系数CV%=2.85%，表明在该试验条件下，结果具有较好的稳定性和可重复性；由回归模型显著性分析可知：在选取的3种考察因素中，C18添加量和pH对合成着色剂的平均回收率有非常显著的影响。

2.2.2 响应面交互作用分析

通过等高线图和3D图可以直观发现各因素交互作用对合成着色剂平均回收率的影响。通过Design-Expert 8.0软件中响应面优化分析方法得出C18添加量、PSA添加量和pH各交互因素对合成着色剂平均回收率的响应面图和等高线图，如图4—6所示。

图4 C18添加量与PSA添加量交互作用的响应面及等高线图

由图4中的等高线可知，C18添加量与PSA添加量之间交互关系呈现为椭圆形，且响应值等高线具有较密集的分布；从3D坡度图看，表现为较为陡峭，表明C18添加量与PSA添加量之间的交互作用对合成着色剂平均回收率影响较大，与方差分析表中的结论相符合。图5、图6中等高线呈现的椭圆均平行于其中一轴，说明影响平均回收率的因素是2个因素中的其中一项，其交互因素不明显。具体来说，PSA添加量与pH交互中，pH的大小对合成着色剂回收率有较为明显的影响；C18添加量与pH交互中，pH的大小对合成着色剂回收率有较为明显的影响。这与表6中得到的结论相一致。

图5 PSA添加量与pH交互作用的响应面及等高线图

图6 C18添加量与pH交互作用的响应面及等高线图

2.2.3 优化条件的确定及验证

通过2.2.1得到的二次多项式方程模型，利用Design-Expert 8.0对最佳提取条件进行预测可得，合成着色剂提取条件为C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH7.63时，可达理论最大回收率99.7%。考虑实际实验情况，提取条件确定为C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH为7.5，按以上选定条件按1.3.6中的方法进行3次验证试验，结果见表7，得出合成着色剂回收率为（97.7±1.25）%，与预测模型结果相比较，回收率接近，表明该优化结果可靠，用于饮料中合成着色剂提取具有可行性。

表7 验证试验

3 结论

文章采用响应面法，在单因素实验的基础上，最终确定C18添加量、PSA添加量和pH三个影响因素用于茶饮料中5种合成着色剂的提取，建立的数学模型具有良好的显著性。通过软件拟合结合实际，确定最佳提取条件为：C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH为7.63。结合实际情况，提取条件确定为C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH为7.5。通过验证试验，证明该模型拟合情况良好，表明采用响应面法优化茶饮料中5种合成着色剂提取工艺切实可行。同时，该方法操作便捷、高效，且使用试剂少，回收率高。为日常茶饮料市场监管提供了一种快速简便的方法。