CircSERPINE2 靶向miR-23a-3p 调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

胡颖婷 邹毅刚 周外平（武汉市第四医院疼痛科，武汉 430030）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的全身性和自身免疫性疾病，滑膜成纤维细胞（culture synovial fibroblasts，FLSs）的异样增生是导致其发生发展的重要原因，在RA 病程中，滑膜转变为增生的侵袭性组织，导致软骨和骨骼的破坏；因此研究其具体分子机制，可为确定未来治疗靶点提供依据和参考［1-3］。非编码RNA（ncRNA）主要包括microRNA（miRNA）、环状RNA（circRNA）等，可作为诊断和治疗RA 的生物标志物［4］。研究报道骨关节炎软骨组织中CircSERPINE2 表达降低与细胞外基质的过度凋亡及合成代谢、分解代谢因子之间的失衡直接相关，CircSERPINE2 过表达可通过miR-1271-ERG 途径减轻软骨凋亡并促进细胞外基质的合成代谢［5］。CircSERPINE2 上调表达可促进胶质母细胞瘤增殖［6］。而CircSERPINE2 对RA 滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-23a-3p 通过直接靶向软骨细胞中的SMAD3 促进骨关节炎的发展［7］。白藜芦醇可通过调控SIRT1/NF-κB/miR-23a-3p/cul3激活SIRT1-Nrf2 信号通路，从而改善RA［8］。因此，本实验旨在研究CircSERPINE2 对RA 滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及机制是否与miR-23a-3p有关。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取于武汉市第四医院就诊的44例RA患者，RA的诊断根据1987年美国风湿病学会修订标准；于清晨空腹抽取其外周血20 ml，同时取44 例同期健康体检者外周血作为对照。伦理审批号：KY2022-077-01。

1.1.2 细胞与主要试剂 人原代滑膜成纤维细胞（SFs）和人原代RA 滑膜成纤维细胞（RA-FLSs）购自美国ATCC；RPMI1640 培养基购自美国Gibco；血浆RNA 提取试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；Trizol 试剂、荧光定量试剂盒购自大连宝生物；RIPA蛋白裂解液、CCK-8 购自北京百奥莱博科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海贝博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组 采用RPMI1640 培养基常规培养FLSs和RA-FLSs，将CircSERPINE2过表达载体及阴性对照、miR-23a-3p 抑制剂及阴性对照转染 至RA-FLSs 中，记 为pcDNA-CircSERPINE2 组、pcDNA 组、anti-miR-23a-3p 组、anti-miR-NC 组，常规培养的RA-FLSs 作 为NC 组；将miR-23a-3p 过表达载体及阴性对照分别与CircSERPINE2 过表达载体转染至RA-FLSs 中，记为miR-23a-3p+pcDNA-Circ-SERPINE2组、miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2组。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Circ-SERPINE2 和miR-23a-3p 表达水平 提取血浆RNA、FLSs及各组RA-FLSs的总RNA，合成cDNA 后进行PCR，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。以GAPDH和U6 为内参。引物序列（5´-3´）CircSERPINE2 F：

GTGCTCACCAGACTGGT，R：TTCACAATCTGATTGAAAAC；GADPH F：AGCCACATCGCTCAGACAC，R：GCCCAATACGACCAAATCC；miR-23a-3p F：CCTTTAGGGACCGTTACACTA，R：TAGTGTAACGGTCCCTAAAGG；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACATA，R：CAGTGCAGGGTCCGAGGTA。

1.2.3 蛋白质印迹法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭后，分别加入1∶1 000稀释的MMP2、MMP9和β-actin一抗4 ℃孵育过夜，再用1∶2 000稀释的二抗室温孵育2 h，发光液显影，分析蛋白条带的相对灰度值。

1.2.4 细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测细胞活性

各组细胞培养48 h，更换为含10%CCK-8 培养液，酶标仪检测孵育2 h后450 nm吸光度值（A）。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭数 用无血清培养液重悬各组细胞，取200 µl 细胞悬液接种于未包被（迁移）或包被基质胶（侵袭）Transwell 上室，下室加入含趋化因子培养液，培养24 h 后将穿膜细胞用4%多聚甲醛固定，再加入结晶紫染色，漂洗干燥，用显微镜拍照并计数，即为细胞迁移或侵袭数。

1.2.6 双荧光素酶报告实验 构建含有miR-23a-3p 结合位点的CircSERPINE2 野生型及突变型报告基因载体，将其分别与miR-23a-3p、miR-NC 转染至RA-FLSs中，按试剂盒说明检测细胞荧光素酶活性。将pcDNA、pcDNA-CircSERPINE2、si-NC、si-Circ-SERPINE2 分别转染至RA-FLSs 中，采用RT-qPCR检测CircSERPINE2和miR-23a-3p的表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用表示，两组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者外周血中CircSERPINE2和miR-23a-3p的表达情况 RA 患者外周血中CircSERPINE2表达水平低于健康体检者，而miR-23a-3p 表达水平高于健康体检者（P<0.05，表1）。

表1 检测外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表达情况（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

表1 检测外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表达情况（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

Note：Compared with healthy control group，1）P<0.05.

2.2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表达情况 与FLSs比较，RA-FLSs中CircSERPINE2表达水平降低，而miR-23a-3p 表达水平升高（P<0.05，表2）。

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表达的情况（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表达的情况（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with FLSs group，1）P<0.05.

2.3 增加CircSERPINE2 表达可抑制RA-FLSs 的增殖、迁移和侵袭 与pcDNA 组比较，pcDNA-Circ-SERPINE2 组细胞MMP2 和MMP9 表达水平降低，CircSERPINE2 表达水平升高，细胞活性降低，迁移数和侵袭数减少（P<0.05，图1、表3）。

图1 Western blot 检 测CircSERPINE2 表达后MMP2、MMP9蛋白表达Fig.1 Western blot analysis of MMP2 and MMP9 protein expressions after CircSERPINE2 expression

表3 CircSERPINE2低表达抑制RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表3 CircSERPINE2低表达抑制RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

2.4 抑制miR-23a-3p表达可抑制RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭 与anti-miR-NC 比较，anti-miR-23a-3p组MMP2 和MMP9 表达水平、miR-23a-3p 表达水平降低，细胞活性降低，迁移数和侵袭数减少（P<0.05，图2、表4）。

图2 Western blot 检测抑制miR-23a-3p 表达后MMP2、MMP9蛋白表达Fig.2 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions after inhibition of miR-23a-3p expression

表4 抑制miR-23a-3p表达抑制RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表4 抑制miR-23a-3p表达抑制RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P<0.05.

2.5 CircSERPINE2 靶向调控miR-23a-3p 的表达

Starbase 预测显示CircSERPINE2 和miR-23a-3p存在结合位点（图3）。miR-23a-3p与CircSERPINE2野生型报告质粒共转染后细胞荧光素酶活性降低（P<0.05，表5）。与pcDNA 组比较，pcDNA-CircSERPINE2 组CircSERPINE2 表达水平升高，miR-23a-3p表达水平降低（P<0.05）；与si-NC 组比较，si-Circ-SERPINE2 组CircSERPINE2 表达水平降低，miR-23a-3p表达水平升高（P<0.05，表6）。

图3 Starbase 对CircSERPINE2 和miR-23a-3p 结合进行预测示意图Fig.3 Schematic diagram of Starbase´s prediction of binding of CircSERPINE2 to miR-23a-3p

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 与CircSERPINE2 报告质粒共转染RA-FLSs 细胞后双荧光素酶活性检测（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 与CircSERPINE2 报告质粒共转染RA-FLSs 细胞后双荧光素酶活性检测（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

表6 RT-qPCR检测miR-23a-3p的表达（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

表6 RT-qPCR检测miR-23a-3p的表达（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

2.6 miR-23a-3p 可逆转CircSERPINE2 过表达对RA-FLSs 增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 组比较，miR-23a-3p+pcDNACircSERPINE2 组MMP2 和MMP9 表达水平、miR-23a-3p 表达水平升高，细胞活性提高，迁移数、侵袭数增加（P<0.05，图4、表7）。

图4 Western blot检测MMP2和MMP9蛋白表达Fig.4 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions

表7 miR-23a-3p可逆转CircSERPINE2过表达对RA-FLSs增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

表7 miR-23a-3p可逆转CircSERPINE2过表达对RA-FLSs增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

Note：Compared with miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 group，1）P<0.05.

3 讨论

滑膜成纤维细胞的大量异常增殖是滑膜组织增生的主要原因，其异常增殖可侵蚀软骨，最终破坏骨关节，加重RA 进展［9-10］。因此，深入了解RAFLSs 异常增殖的分子机制，通过调控相关基因抑制RA-FLSs 异常增殖是有效防治RA 的重要途径和方法。研究报道circSERPINE2 通过调节miR-495/TGFBR2 轴减弱IL-1β 引起的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，是骨关节炎治疗的新靶点［11］。Circ-SERPINE2 通过吸附miR-375 和调 节YWHAZ 表 达促进胃癌细胞增殖［12］。本实验结果显示，RA 患者外周血中CircSERPINE2表达水平低于健康体检者，且RA-FLSs 中CircSERPINE2 表达水平低于正常FLSs，表明CircSERPINE2 可能参与RA 的发病。本实验进一步过表达CircSERPINE2 后，MMP2、MMP9表达水平降低，细胞活性降低，迁移和侵袭细胞数减少，表明过表达CircSERPINE2 可抑制RA-FLSs 的增殖、迁移和侵袭。

研究报道miR-23a-3p 在RA 中失调表达，可能在甲氨蝶呤治疗的RA 患者血液来源的CD19+B 细胞中具有重要的调节功能［13］。新风胶囊可通过下调miR-23a-3p 表达降低骨关节炎患者的炎症反应［14］。本实验结果显示，RA 患者外周血及RA-FLSs中miR-23a-3p 表达水平升高，与在骨关节炎中表达趋势一致。抑制miR-23a-3p 表达后，MMP2、MMP9表达水平降低，细胞活性下降，迁移数和侵袭数减少；表明抑制miR-23a-3p 表达可抑制RA-FLSs 的增殖、迁移和侵袭。此外，本实验还证实CircSERPINE2 靶向调控miR-23a-3p，而miR-23a-3p 过表达可逆转CircSERPINE2过表达对RA-FLSs的影响。

综上所述，CircSERPINE2 过表达可通过靶向调控miR-23a-3p 抑制RA 滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。