水凝胶负载bFGF对氧糖剥夺条件下树突状细胞的影响①

宋潼潼 惠文婷 顾逸雯 杜文靖 陈 霞（吉林大学基础医学院，长春 130012）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，常常危及生命。炎症反应在MI 后的左心室重塑中起关键作用。研究表明，在MI 之后，树突状细胞（dendritic cells，DCs）从骨髓迁移到缺血区，在MI和边界区域积累，参与调控损伤部位的炎症反应［1-2］。因此，基于DCs调控MI后的炎症反应是改善心梗损伤的可行策略。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是调节多种生物学功能的成纤维细胞生长因子的成员。近年研究表明，bFGF治疗可以通过减少体内和体外的氧化应激来保护心脏，缓解MI 损伤和心肌细胞凋亡［3］。然而，由于bFGF的半衰期短，高剂量bFGF 的不当给药伴有各类副作用，包括视网膜病变、低血压、血管瘤、水肿和血小板减少症等，因此bFGF 的治疗给药目前仅限于实验室和临床试验［4］。为克服这一问题，人们尝试开发多种药物递送系统负载bFGF 进行靶向治疗，其中水凝胶载药系统是最受关注的方式之一。

水凝胶在组成和机械性能方面与细胞外基质相似。它们能够在组织再生过程中作为细胞的支持材料，并允许营养物质、代谢物和生长因子的扩散，目前常用于组织工程［5］。本项目中制备的水凝胶缓释贴片采用的原料是由胶原蛋白衍生而来的明胶，具有丰富度高、成本低、生物相容性好、可降解、抗原性低等优点。水凝胶包含亲水性三维交联结构，能够吸收大量水分，为了确保其稳定性和机械性能，课题组以戊二醛为交联剂，通过交联反应合成水凝胶［6］。

目前，已明确bFGF 可靶向包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在内的多种细胞，发挥组织损伤修复作用，但其对DCs 的调控作用尚不明确。本研究在体外模拟MI 条件建立DC2.4 细胞氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，初步探究负载bFGF的缓释水凝胶贴片对OGD 条件下DC2.4细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 细胞采用DC2.4 小鼠树突状细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：CL-0545）。

1.1.2 主要试剂 明胶（国药集团化学试剂有限公司）；戊二醛（福晨化学试剂有限公司）；CCK-8（上海Bimake生物科技有限公司）；高糖DMEM 培养基、无糖DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；TNF-α ELISA 试剂盒（联科生物）；LDH 含量检测试剂盒、MDA 含量检测试剂盒、SOD 活力检测试剂盒（北京索莱宝）。

1.1.3 主要仪器 MCO-170AICUVL-PC CO2细胞培养箱；GC-C0626GC-C03 缺氧小室；D3024R 台式高速冷冻型微量离心机；Tanon-4200SF显影仪；Multiskan FC型酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 明胶水凝胶贴片的制备 使用超纯水在60 ℃水浴加热条件下制备不同浓度的明胶水凝胶（10%和20%），待明胶颗粒完全溶解并搅拌均匀后，将液体迅速转入直径为2 mm，厚度为2 mm 的圆形模具中，在4 ℃条件下进行冷凝。凝固后的水凝胶贴片置于常温下用戊二醛熏蒸不同时长（24 h、48 h）后，将凝胶在-56 ℃下真空冷冻干燥24 h。

1.2.2 bFGF 装载 将10 ng/µl bFGF 的PBS 溶 液通过0.22 µm 膜过滤，并在无菌条件下取100 µl 注入水凝胶贴片进行药物吸附，24 h 左右完成吸附。将凝胶在-56 ℃下真空冷冻干燥24 h。

1.2.3 不同浓度水凝胶贴片溶胀性能检测 将重量为W0的完全干燥水凝胶样品浸入pH7.4 的2 ml PBS溶液中，在不同时间点，用滤纸擦干膨胀水凝胶的表面，并称量其重量Ws。按照公式：溶胀率（SR）%=［（Ws-W0）/W0］×100%，计算水凝胶溶胀性能。

1.2.4 水凝胶细胞毒性检测 将水凝胶贴片浸入DMEM 培养基中，于24 h后收集浸出液，采用CCK-8法评价水凝胶浸出液对正常生长的DC2.4 细胞活力的影响。

1.2.5 建立DC2.4 细胞氧糖剥夺模型 造模前将DC2.4细胞用正常培养基（DMEM+10%胎牛血清+1%双抗），在37 ℃、5%CO2和95%空气条件的培养箱中培养，待细胞生长至密度为80%～90%时进行OGD造模。OGD 处理时将细胞置于无糖DMEM 培养基中，在培养箱中充入94%N2和5%CO2，在37 ℃下培养4 h。

1.2.6 Western blot 造模完成后收集细胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂），于冰上裂解30 min，在4 ℃，12 000 r/min 条件下离心20 min，取上清，采用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白样品浓度。蛋白中加入适量5×loading buffer 于金属浴中加热变性5 min 后迅速置于冰上。将制备完成的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用Image J软件进行统计分析。

1.2.7 ELISA 按照标准品浓度每孔加入50 µl 标准品。在每孔加入10 µl 样品和40 µl 样品稀释液。每孔加入100 µl HRP-conjugate 溶液，37 ℃孵育60 min。吸出孔内的液体，用400 µl清洗液清洗，重复5次。每孔加入50 µl染色剂A和50 µl染色剂B，轻轻吹打混匀，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 µl终止液，孔内颜色由蓝色变为黄色。在450 nm波长下测定吸光度，数据处理。

1.2.8 LDH 活力检测 LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

1.2.9 MDA 含量检测 MDA 与硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）缩合，生成红色产物，在532 nm 处有最大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600 nm 下的吸光度，利用532 nm 与600 nm 下吸光度的差值计算MDA含量。

1.2.10 SOD 活力检测 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-.），可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560 nm 处有吸收；SOD可清除O2-.，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。利用560 nm下的吸光度计算SOD活力。

1.3 统计学处理 实验数据用表示，实验重复至少3 次，结果采用Graphpad Prism 8.0 软件进行统计学分析，两样本间比较采用t检验，多组样本间的比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同制备条件下水凝胶溶胀性能比较 为筛选水凝胶最适制备条件，课题组配制了浓度为10%和20%的明胶水凝胶，并在室温下通过戊二醛熏蒸分别交联24 h和48 h。将冷冻干燥后的水凝胶贴片置于pH7.4 的PBS 溶液中，分别在3 min、5 min、10 min、20 min后检测其溶胀率。如图1A所示，10%的水凝胶溶胀率过高，不适宜用作组织贴片，20%的水凝胶在不同熏蒸时长下溶胀率差异不明显，因此选择浓度为20%，戊二醛熏蒸时长24 h 的水凝胶贴片（图1B）进行后续实验。

图1 不同制备条件下水凝胶溶胀率Fig.1 Hydrated rate of hydrogel under different preparation conditions

2.2 水凝胶细胞毒性检测 为明确水凝胶贴片是否影响细胞正常生长，课题组将20%明胶水凝胶、戊二醛交联24 h 的20%明胶水凝胶贴片，分别浸入DMEM 培养基中，于24 h 后收集浸出液，加入正常培养的DC2.4 细胞中，采用CCK-8 检测共培养6 h、12 h、24 h 后的细胞活力。结果如图2 所示，与正常培养的对照组相比，20%明胶水凝胶与DC2.4 细胞共培养24 h 对细胞活力无明显影响，使用戊二醛交联24 h 的20%明胶水凝胶贴片与DC2.4 细胞共培养6 h 均对细胞活力无明显影响，共培养12 h、24 h后对细胞活力仅有轻微抑制作用（P<0.05）。

图2 水凝胶细胞毒性检测Fig.2 Hydrogel cytotoxicity assays

2.3 负载bFGF 水凝胶贴片对氧糖剥夺后DC2.4细胞炎症因子表达的影响 为明确水凝胶负载bFGF 对氧糖剥夺后DC2.4 细胞炎症因子表达的影响，课题组采用Transwell 小室，建立了DC2.4 细胞和负载bFGF 的水凝胶贴片共培养体系。氧糖剥夺4 h 后采用Western blot 法检测各组DC2.4 细胞炎症因子表达情况。结果如图3所示，与对照组相比，氧糖剥夺4 h后DC2.4细胞中IL-1β、Nlrp3蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01），bFGF 组与负载bFGF的水凝胶组显著降低了IL-1β 表达水平（P<0.05），bFGF 组与负载bFGF 的水凝胶组显著降低了Nlrp3表达水平（P<0.05）。以上结果提示，负载bFGF 的水凝胶贴片可以明显抑制氧糖剥夺后DC2.4 细胞促炎因子的表达。

图3 DC2.4细胞炎症因子表达Fig.3 Expressions of inflammatory factors in DC2.4 cells

2.4 负载bFGF 水凝胶贴片对氧糖剥夺后DC2.4细胞TNF-α 分泌的影响 为明确水凝胶负载bFGF对氧糖剥夺后DC2.4 细胞炎症因子分泌的影响，课题组采用Transwell 小室，建立了DC2.4 细胞和负载bFGF的水凝胶贴片共培养体系。氧糖剥夺4 h后采用ELISA方法检测各组DC2.4细胞上清中炎症因子TNF-α 含量。结果如图4 所示，与对照组相比，氧糖剥夺4 h 后DC2.4 细胞上清中TNF-α 含量明显增加，负载bFGF 的水凝胶组明显减少了细胞上清中TNF-α含量。以上结果提示，负载bFGF的水凝胶贴片可以明显抑制氧糖剥夺后DC2.4 细胞促炎因子TNF-α的分泌。

图4 DC2.4细胞TNF-α分泌情况Fig.4 TNF-α secretion in DC2.4 cells

2.5 水凝胶负载bFGF 对OGD 后DC2.4 细胞氧化应激反应的影响 为明确负载bFGF 的水凝胶对OGD 后DC2.4 细胞的保护作用。课题组检测了OGD后细胞中SOD和LDH活力，并检测了细胞上清中MDA 含量。结果如图5 所示，负载1 µg bFGF 的水凝胶贴片与DC2.4 细胞共培养，可显著增加OGD 4 h 后细胞SOD 活力（P<0.01），并明显减少细胞LDH 活力（P<0.05）和细胞上清中MDA 含量（P<0.01）。以上结果说明负载bFGF 的水凝胶贴片可以减轻氧糖剥夺对DC2.4细胞的损伤。

图5 DC2.4细胞SOD活力，细胞上清LDH活力和MDA含量Fig.5 SOD activity in DC2.4 cells，LDH activity and MDA content in cell supernatant

3 讨论

MI后大量心肌细胞死亡，诱导心肌组织不良重塑，包括心室壁变薄、瘢痕组织形成等，最终导致心力衰竭。传统的冠状动脉搭桥手术和药理学方法，虽然可以降低心力衰竭死亡率，但难以恢复心肌功能。近年来，包括可注射生物材料和心脏贴片在内的各种技术已被开发出来，以重建梗死心肌的功能［7］。

早有研究指出，bFGF的心肌内给药可诱导血管新生，改善心肌功能。但bFGF 治疗方法最重要的局限性是其生物学半衰期过短，因此，需要将bFGF持续性递送到细胞靶标以达到预期的效果。为此，缓释蛋白递送系统提供了可行策略。本研究中利用水凝胶的高溶胀能力负载治疗剂量的bFGF。由于整个负载过程是在室温下，pH7.4 的PBS 溶液中进行的bFGF 的活性损失可以最小化。本研究采用的载药水凝胶贴片是由明胶制成，明胶是一种天然的，可生物降解的动物蛋白，由胶原蛋白通过酸或碱催化的水解产生，广泛用于化妆品，制药和食品配方中［8］。负载bFGF 的明胶水凝胶已被证明可以用于鼓膜再生、改善缺血皮瓣存活率、促进伤口愈合等［9-11］。通过检测其细胞毒性作用，明确了本研究中制备的明胶水凝胶贴片对细胞正常生长无明显影响，安全性有一定保障，适宜用于后续体外或体内试验。

使用水凝胶的一个值得关注的方面是根据预期应用适当调整其机械性能，这是通过实施不同的策略来实现的，包括酶交联、物理交联、化学修饰和化学交联［12］。化学交联产生的共价键的强度能够提供生物医学应用所需的机械力，包括组织工程和药物递送［13］。为了使明胶水凝胶具备药物递送所需的机械力，本课题组使用戊二醛熏蒸的方法对其进行化学交联。戊二醛是一种有效的双功能交联剂，水溶性强，高效且经济［14］。本研究也验证了戊二醛交联对细胞活力的影响，结果显示戊二醛熏蒸过后的明胶水凝胶对细胞活力无明显抑制，具有一定的安全性。

心肌梗死后梗死区域的DCs 浸润显著增加［15］。DCs 在触发自身免疫中具有核心作用。据报道，组织损伤后，骨髓和脾前体以及循环单核细胞分化为DCs，这些细胞对炎症部位的免疫系统产生各种影响，例如引发抗原特异性免疫反应、诱导耐受和慢性炎症。研究表明，在AMI之后，DCs从骨髓迁移到缺血区，在MI 和边界区域积累（在MI 后7 d 达到峰值），DCs相关的促炎作用与AMI后更严重的不良左心室重塑有关［16］。因此，调控DCs 功能可对心梗损伤修复发挥有利作用。本项研究，为在体外模拟心肌梗死环境，建立了OGD 细胞模型，揭示了负载bFGF 的水凝胶贴片可以明显抑制OGD 后DCs 促炎因子的表达。

越来越多的研究证实，氧化应激参与心肌梗死的病理进展。氧化应激主要表现为含有羟基的自由基、超氧化物、NO 等的活性氧过度积累，当以活性氧为代表的氧化物量超过SOD 等抗氧化剂的抗氧化能力时，就会引起脂质、蛋白质和DNA 的氧化损伤，并伴有炎症、肌细胞凋亡和间质纤维化等［17-18］。本研究发现，负载bFGF 的水凝胶贴片可以明显增加OGD后DC2.4细胞SOD活力，减少膜脂过氧化产物MDA 的含量及LDH 酶活力，改善了氧化应激反应。因此，本载药系统后续有望在心梗体内模型中发挥调控免疫反应的作用。

本研究目前有几个局限性。首先，本载药系统的生物相容性、降解能力等需要进一步验证，同时有必要添加其他生物材料来改善其溶胀性能。此外，课题组进行了细胞实验，以证实负载bFGF 的水凝胶贴片对DCs 表达炎症因子的影响，但需要使用动物模型进行进一步研究。例如，将负载bFGF 的水凝胶贴片递送至心肌梗死部位，探究其对心梗后DCs 功能和免疫微环境的调控作用。总体而言，含有bFGF 的水凝胶显示出调控心梗后炎症反应的巨大前景，未来课题组将进一步改善其性能，使其在临床应用中发挥作用。