基于蛋白质组学的艾滋病肺脾气虚证PBMC小G蛋白相关研究①

于桢钰 张 淼 王 娟 马素娜 谢世平 许前磊（河南中医药大学，郑州 450046）

小G 蛋白属于G 蛋白大家族，除了参与细胞的生长增殖、细胞骨架调节及细胞信号转导等外，也与免疫、炎症、自噬及凋亡等方面密切相关［1-4］。获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）即艾滋病，是感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）后，CD4 免疫细胞被攻击引起一系列免疫缺陷的传染性疾病［5］。研究发现，小G 蛋白在艾滋病感染进程中扮演重要角色，不论是其进入及潜伏的机制，还是后续激活发病分泌等机制均有重要联系，但具体机制尚不明确［6-8］。肺脾气虚证是艾滋病感染者的常见证候之一，气是维持人体细胞运化的关键，小G蛋白作为细胞骨架的重要组成及其信号调节者，与气的推动、防御及气化功能十分相似，因此本研究选取了艾滋病肺脾气虚证外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）进行研究［9］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 收集2018 年河南省某地艾滋病肺脾气虚证患者及同地区健康对照者血液样本各20例，提取PBMC，设为艾滋病肺脾气虚证组及健康对照组，进行iTRAQ-MS 检测。获取一般信息，对艾滋病肺脾气虚证组及健康对照组的性别与年龄进行统计，差异无统计学意义，说明组间具有可比性（表1）。中医证型诊断标准：参考课题组“艾滋病中医证候分布规律及证候标准建立与验证”中“HIV/AIDS 常见证候诊断量表”肺脾气虚证诊断量表（编号：90409004）［10］。艾滋病肺脾气虚证组纳入标准：①HIV 抗体阳性且中医诊断为肺脾气虚证；②年龄18～60 岁；③自愿签署知情同意书者。排除标准：①患者并发严重机会性感染者；②神志不清、痴呆、不愿配合及不愿签署知情同意书者。健康对照组纳入标准：①同地区HIV 抗体检测阴性者，年龄为18～60 岁；②无严重脏器疾病或慢性病急性发作者；③无神志不清、痴呆、各种精神病者；④自愿签署知情同意书者。本研究经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（批件号：2018HL-050-01）。

表1 HIV/AIDS 肺脾气虚证组（F）与健康对照组（J）基线资料Tab.1 Baseline data of HIV/AIDS lung spleen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

1.1.2 主要仪器及试剂 Human 14 多重离心亲和去除系统购自Agilent；iTRAQ 试剂盒购自AB SCIEX公司；C18柱购自Sigma。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取 EDTA 真空采血管采集入组者晨起外周血10 ml，加等体积PBS吹打均匀。将稀释后的血液缓慢加在Ficoll液面上，2 000 r/min离心20 min，收取白膜层（PBMC），洗涤离心（1 500 r/min 10 min），重复2 次。弃上清加1 ml 细胞冻存液，-80 ℃保存。

1.2.2 iTRAQ-MS检测

1.2.2.1 样本采集及混合 艾滋病肺脾气虚证组的20 例PBMC 标本分为4组，记为FP01、FP02、FP03、FP04。健康对照组的20 例PBMC 标本分为4 组，记为JK01、JK02、JK03、JK04。每组5 例，每例取出10 µl样品置于EP管中涡旋混合。

1.2.2.2 蛋白质的提取及定量 在样本中加入蛋白裂解液混匀，冰浴5 min，加入DTT，冰浴超声15 min，13 000 g 离心20 min，加入冷丙酮，-20 ℃过夜，加入TEAB 溶解，56 ℃水浴30 min，静置30 min，采用Bradford 法测定蛋白浓度。

1.2.2.3 蛋白质酶解及iTRAQ 标记 胰蛋白酶消化样品蛋白质，将酶解后的肽段经C18 柱脱盐真空冷燥，加入TEAB 溶解多肽，按照iTRAQ-8 试剂盒说明书进行标记混合。

1.2.2.4 液相色谱-质谱分析 2%乙腈/0.1%甲酸溶解多肽样本后，应用质谱仪分析样本，多肽溶液与C18 捕获柱洗脱（缓冲液梯度90 min，流速300 nL/min），流动相A：2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O，流动相B：98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O。在离子累积时间为250 ms 条件下进行一级质谱图扫描，离子累积时间50 ms条件下收集30个前体离子的二级质谱图。MS1 光谱于350～1 500 m/z 条件内收集，MS2光谱在100～1 500 m/z条件下收集。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件分析数据。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，计数资料组间对比采用卡方检验。按照flod change>1.5 或flod change<0.67 标准筛选，P<0.05 结果视为差异蛋白，组间对比采用t检验进行差异显著性评估。查库鉴定：将差异蛋白在UniProt（https：//beta.uniprot.org）网站中进行搜索。

2 结果

2.1 一般信息 对艾滋病肺脾气虚证组（F）及健康对照组（J）的性别与年龄进行统计比较，P>0.05，表明组间具有可比性（表1）。

2.2 蛋白鉴定结果 如表2 所示，按照筛选标准，结果显示相比于健康对照组，艾滋病肺脾气虚证组差异表达蛋白为222 个，其中上调蛋白169 个，下调蛋白53 个。将差异蛋白在UniProt 网站中进行搜索，筛出小G 家族相关蛋白，结果显示9 个显著上调的小G 蛋白，分别为：Rho 家族Rac1、Cdc42、RhoA；Rab 家 族Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab21、Rab27B；Rap家族Rap2B。

表2 HIV/AIDS 肺脾气虚证组（F）与健康对照组（J）差异小G蛋白Tab.2 Difference of small G protein between HIV/AIDS lung slpeen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

3 讨论

小G 蛋白是细胞活动的关键调节者，作为不活跃的鸟苷二磷酸（GDP）结合状态和活跃的鸟苷三磷酸（GTP）结合状态的分子开关，作用于整个细胞，包括细胞膜、细胞质和细胞核，调节了细胞的增殖分化、细胞信号、囊泡运输、迁移或凋亡等［1，11-12］。小G蛋白家族包括Rho、Rab、Rap 等成员，其中Rho 主要参与细胞骨架的动力与形态，Rab 主要负责膜转运及囊泡运输，Rap 参与细胞的黏附、迁移及信号转导等［11，13］。小G 蛋白作为GDP/GTP 分子开关，通过招募特定结合伙伴，如各种激酶、磷酸酶及运动蛋白影响囊泡的形成和运输，HIV 病毒可利用细胞运输机制组装和释放新的传染性颗粒［14］。本实验运用iTRAQ-MS 蛋白质组学检测方法，以艾滋病肺脾气虚证为研究对象，筛选出其与健康对照组PBMC 差异表达的9个小G蛋白。

3.1 Rho GTPase 家族 RhoA、Rac1 和Cdc42 在本次实验中显著上调，三者关系密切，且皆为Rho GTPase 家族成员，在病毒生命周期的不同阶段调节HIV-1 的复制，参与病毒的进入、转录和释放［14］。HIV 可通过Env 包膜蛋白触发RhoA、Rac1 与Cdc42信号激活；RhoA 和Rac1 通过提高Env 蛋白与CD4和辅助受体分子（CXCR4/CCR5）的结合聚集及病毒-细胞膜融合的效率促进HIV-1 病毒的进入；CD4和辅助受体分子CCR5 的病毒接合又激活Rac1 和Cdc42，并导致GTPase 信号级联中蛋白质大规模磷酸化与肌动蛋白重塑，可促进HIV 病毒融合孔的形成和扩大［6，12，15-16］。与Env 蛋白相似，Nef 也 介 导Rac1 活性，Env 与Nef 的介导效应与Rac1/Cdc42-Wave2-Arp2/3 肌动蛋白聚合途径有关［17］。LUCERA等［8］研究表明细胞骨架调节因子Rho GTPase家族中RhoA、Cdc42 和RhoA 的抑制剂可降低病毒感染，表明Rho 信号家族的多个成员是促进CD4+T 细胞最佳HIV-1 感染的宿主依赖性因素。NIKOLIC 等［16］研究表明HIV-1 激活了Cdc42，促进了HIV 病毒在树状突细胞和CD4+T细胞之间形成的感染性突触间的传播。总之，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 与细胞骨架调节密切相关，且与HIV 病毒的进入、复制及传播有关，而抑制其相关活性可减少病毒感染。本研究中，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 蛋白对比健康组呈现的上调差异可能与病毒感染相关，对此需进一步实验验证。

3.2 Rab GTPase 家 族 Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab27B、Rab21 等差异蛋白在本次实验结果中上调，其属于GTPase 家族中的Rab 家族。Rab GTPase蛋白除了与HIV 病毒感染相关，也与自噬及细胞凋亡炎症关系密切［2，4，18］。

CAILLET 等［14］证明了Rab7A 是HIV-1繁殖所必需的，Rab7A 调节Env 蛋白的加工与HIV-1 的传染性，Rab7A 耗竭降低了Env 的加工，削弱了病毒的传染性；Rab7A 敲除细胞释放的病毒，传染性降低，其与限制性因子BST2 的表达有关（BST2 可将新形成的病毒颗粒物理束缚在感染细胞表面，阻止其释放）。RAB7A 能够调节AKT（蛋白激酶B）和PAK1（P21-activated kinase1）活性，AKT 和PAK 都与细胞凋亡通路有关；而RAB7A 的过度表达也导致NF-κB表达增加［3］。MARGIOTTA 等［19］实验表明Rab7A 控制晚期内吞转运，直接与Rac1 相互作用，Rab7A 和Rac1 之间的协调是将自噬与细胞内运输和信号传递相结合的关键。BAYLISS 等［20］实验发现Rab8A是HIV-1转运到病毒学突触（VS）从而感染CD4+T细胞的重要调节因子，敲除Rab8A 潜在地阻止了病毒通过VS的有效反式感染，Rab8A可控制囊泡运输和促进膜突起，Rab8A缺失抑制了膜的突起，从而减少了HIV-1的反式感染。Rab13通过激活AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK），阻断mTOR 信号转导靶点，从而调节细胞自噬［18］。Rab27b 参与了内体-溶酶体途径，与Rab8A 共同参与了自噬体形成［21］。LI 等［22］研究表明Rab21 可通过促进TLR4 内体运输和下游信号激活调节脂多糖诱导的促炎反应，Rab21 的敲除有效抑制了脂多糖诱导的多种促炎细胞因子如IL-1b、IL-6和TNF-α表达。

以上结果表明，Rab 相关的几个蛋白的下调或敲除限制了病毒感染，而其上调与激活似乎诱导加重了炎症反应及自噬。在本实验中，Rab7A、Rab8A出现上调，这可能说明HIV/AIDS肺脾气虚证患者体内存在正在进行的病毒细胞间感染。相关Rab蛋白同时出现上调也可能与HIV/AIDS 长期慢性感染炎症相关，尚需进一步实验证明。

3.3 Rap GTPase 家 族 Rap2B 是Rap GTPase 成员，参与调节细胞过程，包括细胞骨架组织和细胞增殖，Rap2B相关转导在自噬过程、突触形成等方面作用复杂［23］。Rap2B 诱导了ERK 的磷酸化，是p53的直接靶基因，在细胞凋亡和迁移的调控中以p53依赖的方式发挥作用［24-25］。Rap2B 同时可以促进MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等多种信号通路的激活［26］。MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等通路与HIV 的感染与致病密切相关，HIV 病毒Nef 及Tat 蛋白可通过调控T 细胞 ERK 激酶活性调节病毒的转录、感染及复制［27-28］。DEL等［29］研究也表明HIV-1感染改变了T 细胞表面分子表达，改变了细胞骨架重塑及相关的细胞事件，并通过影响各种信号通路调节T 细胞活化。Rap2B 在艾滋病肺脾气虚证组中上调，可能与病毒感染导致的T细胞活化相关。

肺脾气虚证是艾滋病中最常见的临床证型之一，肺脾气虚证患者易出现感冒、咳嗽、泄泻、自汗、乏力等症状，肺脾气虚证患者由于肺之生发百脉主治节功能受损，脾之气血生化来源不足，引起气的推动、防御及气化功能下降，导致感染者正气不足，抵抗力弱，机体内环境调节出现紊乱。实验中发现了9 个上调的小G 蛋白差异表达，结合文献研究发现小G 蛋白Rho GTPase 家族在病毒的伊始攻击中发挥更重要作用，Rab GTPase、Rap GTPase 家族在病毒进入细胞后的复制转录及激活各种通路引发的后续炎症、自噬和凋亡等中发挥作用，这正与机体各方面机能代谢信号传导密切相关，但其在感染HIV病毒病程及肺脾气虚证中的具体功能作用仍处于探索阶段。本研究进行了证型的初步蛋白筛选，有助于进一步研究小G蛋白与艾滋病肺脾气虚证的感染及发病相关机制，课题组后期将对小G 蛋白进行深入研究，以期为中西医结合治疗艾滋病提供新思路。