麻类韧皮纤维细胞骨架制备条件优化研究

冷 超，王克臣，周亚东，苏 钰，李 明*

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨学院，哈尔滨 150080）

细胞骨架（Cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。细胞骨架的概念有狭义和广义之分。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、（核内骨架及分裂期染色体骨架和核纤层）、细胞质骨架、细胞膜骨架、细胞外基质，它们在结构上相互连接，形成贯穿于细胞的网架体系。狭义的细胞骨架仅指细胞质骨架。在典型的高等真核细胞中，细胞骨架由三种不同类型的纤维系统构成：微管、中间纤维和微丝[1]。细胞骨架系统是当前细胞生物学研究中最活跃的领域之一，近年来其研究方法多为应用免疫荧光技术标记细胞骨架系统[2-5]，而Pena发明的考马斯亮蓝染色法[6]，具有简单、方便、快速和经济的优点[7]。本试验选择考马斯亮蓝染色法，对1%Triton X-100抽提非骨架蛋白的时间进行了优化，制备出了北方三种麻类韧皮纤维细胞骨架（狭义），并进行了初步观察，一方面为其他麻类纤维细胞骨架制备研究提供参考；另一方面为下一步采用免疫荧光法研究细胞壁加厚机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用了三种北方麻类：亚麻，大麻和青麻，其中亚麻选择了不同类型的3个品种：RAISA（早熟高纤）、双亚3号（晚熟高产）、VIMY（油用）。

1.2 方法

参照文献[8]配制试剂。在亚麻、大麻和青麻开花后期，选取生长良好的代表性植株中部茎段（纤维细胞的次生壁开始加厚），取新鲜的韧皮纤维细胞，立刻进行下列操作：①取材：将上述材料放入盛有6 mmol·L-1PBS的小烧杯中，使其下沉，处理5～10 min；②抽提：吸去PBS，用1%Triton X-100处理20、25、30、40 min（37℃恒温箱中）；③冲洗：吸去1%Triton X-100，M缓冲液充分洗3次，每次5 min；④固定：室温3%戊二醛固定20 min；⑤ 冲洗：吸去固定液，6 mmol·L-1PBS洗3次，每次5 min，滤纸吸去残液；⑥染色：0.2%考马斯亮蓝R250染色20 min；⑦制片：蒸馏水洗2～3次，将标本置于载玻片上，加盖玻片观察。在Olympus光学显微镜下镜检，并在DCE-1数码目镜下照相。

2 结果与分析

2.1 亚麻纤维细胞的细胞骨架

不同时间对细胞骨架图像的影响很大，当用1%Triton X-100抽提20 min时，RAISA的纤维细胞中仍有少量杂质（见图版Ⅰ-A），但是抽提40 min时，细胞中只有少量的骨架蛋白存在（见图版Ⅰ-B），部分骨架也被Triton X-100抽提走。图版Ⅰ-C、D均为1%Triton X-100抽提30 min，细胞骨架系统清晰可见，后者中可见2个细胞核和纤丝结构。

其他2个亚麻品种双亚3号和VIMY同样是被1%Triton X-100抽提30 min效果最好，韧皮纤维细胞骨架系统清晰可见纤丝结构，这种结构也互相结合成网络（见图版Ⅱ-A、B）。由图版Ⅱ-C可知，VIMY被1%Triton X-100抽提20 min时，细胞中的蛋白杂质多，明显看不出骨架；图Ⅱ-D为抽提VIMY 40 min，观察不到其细胞内骨架。

图版Ⅰ 亚麻RAISA韧皮纤维细胞骨架PlateⅠ Fibre cytoskeleton of flax varieties RAISA

图版Ⅱ 亚麻双亚3号、VIMY韧皮纤维细胞骨架PlateⅡ Bast fibre cytoskeleton of flax varieties Shuangya3 and VIMY

2.2 大麻与青麻纤维细胞的细胞骨架

试验结果显示对于开花后期的大麻和青麻均为1%Triton X-100抽提30 min效果最好，图版Ⅲ-A和Ⅲ-B表示不同放大倍数的大麻韧皮纤维细胞骨架，丰富的纤丝结构清晰可见；图Ⅲ-C为1%Triton X-100抽提非骨架蛋白30 min，高倍镜下可见青麻韧皮纤维细胞骨架和圆形的细胞核，为了观察其细胞核，且由于细胞是三维结构，在显微摄影时，位于非聚焦面上的纤丝结构就不能被观察到，从而图版Ⅲ-C中纤丝结构看起来不够丰富。抽提40 min后的大麻韧皮纤维细胞骨架同样有骨架蛋白被抽提，结构不完整，而抽提40 min后的青麻韧皮纤维骨架蛋白被抽提，几乎看不见细胞骨架（见图版Ⅲ-D）。

图版Ⅲ 大麻和青麻韧皮纤维细胞骨架PlateⅢ Fibre cytoskeleton of hemp and abutilon

3 讨论与结论

细胞骨架发现较晚，主要是因为一般电镜制样采用低温（0～4℃）固定，而细胞骨架会在低温下解聚。直到1963年Slauterback改用戊二醛作固定剂，首次在水螅刺细胞中观察到微管，此后研究者们便开始了对细胞骨架的探索[9]。尽管目前对细胞骨架系统显示的研究方法多集中在免疫荧光上，但是考马斯亮蓝染色法也不失为一种简单、方便、快速和经济的试验方法。

本研究表明，利用Triton X-100在37℃条件下，抽提开花后期细胞次生壁加厚的麻类韧皮纤维细胞骨架非蛋白时间为30 min较为合适。若时间稍短一点如20 min，在细胞中会有脂质和蛋白质抽提不完全；相反，抽提时间为40 min时就会有骨架蛋白被破坏，使得结构不完整。有研究者对洋葱细胞骨架制备中发现，1%Triton X-100抽提非骨架蛋白25 min观察效果较好[10]，这可能是由于研究材料不同造成的（例如细胞壁厚度不同）。在试验中也发现，因为麻类纤维细胞次生壁会不断的加厚，所以如果取材的阶段不同，那么纤维细胞壁厚度就会不同，最终就可能会影响到抽提时间的不一致。在国内尚未见到关于麻类韧皮纤维细胞骨架的研究报道，在此情况下，采用考马斯亮蓝染色法可以快速的了解其细胞骨架系统，掌握对麻类韧皮纤维细胞骨架结构显示方法。另外，动力学可变性是细胞骨架的一个最大特征。即植物细胞在一定膨压下扩展或伸长时，细胞壁就会按一定的方向和模式扩张，此时已有的细胞壁构架必须改变，以加入新的细胞壁原料。细胞骨架通过指导细胞壁原料的沉积在植物细胞的生长控制和空间调整中发挥作用[11]。本试验应用免疫荧光法研究纤维素微纤丝如何在细胞壁中沉积，即微丝和微管如何影响纤维细胞壁的加厚过程，为今后此方面的研究奠定基础。

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