Ran调节因子RanBP1的生物学作用

曾 晓，孙露霜，杨立琳，曹允考

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

Ran（Ras-related Nuclear）是小型的 Ras相关蛋白，Ran在所有已研究过的有机体中都存在，它们是生存所需要的基本物质，对真核细胞中有丝分裂和减数分裂开始和结束的控制，及其间纺锤体的组装、染色体的正确分配、核膜破裂和重组等都起一定的作用[1]。Ran的作用是在其调节物RanGEF（Guanine Nucleotide Exchange Factors）、RanGAP1（RanGTPase Activating Protein 1）、RanBP1（Ran Binding Protein 1）和 RanBP2（Ran Binding Protein 2）等的调节下，Ran连接的GTP/GDP发生转换实现的。RanBP1是其中的一个主要调节因子，目前国内外有很多学者对其进行了大量的研究。

RanBP1是Ran家族最小的成员，是第一个被鉴定的Ran结合蛋白，最早是对CG-丰富的序列进行功能筛选中被克隆出来[2]。分子质量为23 ku，由201个氨基酸构成，没有真正的GAP活性和功能，但可作为GEF抑制器使RCC1失活，间接增加RanGDP变为RanGTP的比值。RanBP1可以被看作是RanGTPase循环中的关键调节因子，从酵母到人类都是高度保守的[3]。RanBP1对细胞的一些生物过程：如细胞的核-质运输、纺锤体的组装、细胞周期、有丝分裂控制、有丝分裂结束后核重组等都有一定的作用。

1 RanBP1细胞的核质间物质运输中的作用

真核细胞中离子、小的代谢物和分子质量小于40～60 ku的蛋白质能够通过核孔复合物（Nuclear Pore Complex，NPC）环绕的水溶性通道来被动扩散。多数分子质量大于40～60 ku的大分子蛋白以主动运输的形式穿过NPC。许多试验证明，蛋白质的主动内输和外运分别是由被称为核定位信号（Nuclear Localization Signal，NLS）和核外输信号（Nuclear Export Signal，NES）的短氨基酸片段介导的。大量的研究表明，Ran的调节物在细胞中的空间定位可以使间期时的细胞核内产生高浓度的RanGTP，而细胞质内产生的RanGTP浓度很低并且量是非常有限的，这种核内与核外有较高的RanGTP浓度差是调节核质转运方向必须的[1]。

RanBP1作为Ran的重要调节因子也在其中起到一定作用。Rexach和Blobel用提纯了的重组蛋白来进行连接分析的方法显示RanGTP能使固定后的核蛋白释放出由NLS、importinα（内输蛋白α）和importinβ（内输蛋白β）构成的复合物，并使NLS/importinα从 importinβ上游离出来。RanGTP和importinβ直接连接，通过与RanBP1相互作用而保持稳定。当RanGTP.importinβ.RanBP1与RanGAP1相作用时，RanBP1可刺激Ran连接的GTP水解成GDP，从而破坏复合物，使RanBP1被释放出来，从而促进由 RanGDP、importinβ 和 importinα.NLS，以及与内输因子P10一起装配成内输复合物[3]。

相反，富含亮氨酸的NES在高浓度的RanGTP中被CRM1识别，在核内形成NES.CRM1.RanGTP三聚体复合物，这个三聚体复合物在不需要GTP水解的情况下从NPC转运到细胞质。然后，在RanGAP1和RanBP1/RanBP2的作用下GTP水解，使三聚体解聚。

2 RanBP1随细胞周期的变化

哺乳动物RanBP1基因的表达受细胞周期各时期的条件控制。RanBP1基因转录在分化和休眠的细胞中效率低，但在分裂活跃的细胞中效率高。类视色素受体家族的因子对它起控制作用[4]。RanBP1蛋白水平随细胞周期变化而变化，从S期到M期增加，有丝分裂中期达到高峰，分裂末期突然降低。在间期细胞中，RanBP1大部分位于细胞质中[5]。

与相同的组织学起源的未转化细胞相比，转化型细胞（Hela细胞）中的RanBP1mRNA和蛋白过表达。在一个周期正常的细胞中，RanBP1转录在中期调节物E2F和pRb的调控下，在G1/S点被激活[6]。进入S期后，在E2F/pRb直接控制下，发生高水平的RanBP1表达，同时，细胞周期进程中需要的许多其他基因也开始表达。这种类视色素受体和E2F/pRb通道的双重控制表明，RanBP1在Ran网状体系和有丝分裂装置的之间起中枢调节作用。

3 RanBP1在纺锤体组装中的作用

染色体分离依靠双极纺锤体的活动，纺锤体由聚集的微管（MTs）组成。RanGTP和RCC1已被证明在MT形成中发挥积极作用，而过量的RanBP1，RanGAP1或者Ran突变体（T24N）抑制RCC1作用，进一步抑制MTs的形成和纺锤体组装[7]。在无细胞的提取物中，这些影响明显是不依赖于转运的。回顾在鼠类细胞中解除噻氨酯哒唑的抑制作用后所看到的结果，和在非洲爪蟾提取物的研究中所得出的作用机制是一致的。RanBP1水平升高，会扰乱在无细胞提取物中对MT形成起关键作用，依赖于RanGTP的相关作用，并且对噻氨酯哒唑去除后的MT生长和聚集的恢复有抑制作用。

有丝分裂在鼠类细胞的特征进一步表明，在整个细胞周期中，RanBP1过表达诱导多极纺锤体的产生。这些异常的纺锤体是由有丝分裂中心体内聚力丧失引起的。尤其，RanBP1过剩导致纺锤体极的中心粒分离，分开的中心粒能够各自组装有功能的微管排列，产生功能性的纺锤体极。依赖于RanBP1的中心粒分离在有丝分裂中被诱导产生，这要求微管完整和有活性的Eg5（调节中心粒分离的驱动蛋白）参与。证明RanBP1过表达对有丝分裂期间中心体的结构和动力学特点的关键因子会具有干扰作用[8]，多极和单极的现象在整个有丝分裂过程直到细胞分裂的末期都能看到，出现染色体在每个极的分配不均等，或者分离失败[5]。

4 RanBP1对有丝分裂的调节

RanBP1是哺乳动物细胞Ran网状体系的细胞周期调节因子，从G2期到细胞分裂后期保持高水平的状态表明，相对于细胞周期的早期阶段，在有丝分裂细胞中依赖于Ran的相互作用的调节要求RanBP1的浓集增强。事实上，RanBP1在哺乳动物细胞有丝分裂中明显起作用，因为，它的过表达引起多极纺锤体的形成，并破坏有丝分裂的结束，但是，抗RanBP1的特异性抗体注射致使有丝分裂MTs抵抗噻氨酯哒唑（Nocodazole,NOC）诱导的解聚作用并产生染色体分配错误。因此，RanBP1对纺锤体形成和动力学有调节作用，而且，它和Ran的比率对于被调控过程的下游区是至关重要的[9]。

很多试验表明，RanBP1在有丝分裂的细胞质中积聚。将抗RanBP1的抗体注入哺乳动物有丝分裂细胞中，观察体内进行有丝分裂的过程，在前期或前中期纺锤体形成不受影响，而且染色体在赤道板上的排列正常，这和非洲爪蟾中的研究结果一致，可是接下来的有丝分裂过程的分裂后期被严重推迟，进一步出现姐妹染色单体分离失败或不完全分离[5]。

最新研究表明，在RanBP1被耗尽的细胞中，发生前中期的细胞分裂延迟，或出现细胞凋亡。仍有活力的细胞装配形态正常的纺锤体，但这些纺锤体过于稳定，不能对细胞周期调节蛋白B1（Cyclin-B1）进行补充，也不能对微管稳定因子HURP（DLG7）向微管正末端的定位进行限制。RanBP1缺失不增加独立染色体出现的频率，经常出现细胞分裂后期同源染色体的分离滞后。这些资料表明，RanBP1活性对调节微管功能特殊因子的正确定位是必须的，这种RanBP1活性的缺失增加以依赖于微管方式进行的非整倍性细胞增殖[9]。

RanBP1也有助于调整有丝分裂装置的功能。RanBP1失活产生MTs过稳定，并在有丝分裂中导致编程性细胞死亡。综合微管稳定药物紫杉醇的作用，研究在转化细胞自然发生的和紫杉酚诱导的凋亡过程中RanBP1的作用，研究表明，不考虑p53的水平，通过RNA干涉使RanBP1水平下调，使几种转化的细胞系发生编程性细胞死亡，但是在MCF-7乳腺癌细胞中，半胱天冬酶-3（细胞凋亡蛋白酶）缺失时这种反应不发生。和RanBP1水平正常或较高的细胞比较，RanBP1干涉的细胞对紫杉酚处理产生的细胞凋亡反应增强，而这个反应是依赖于细胞凋亡蛋白酶的。这些结果表明RanBP1在靶向作用于MT的药物治疗中有调节作用[10]。

5 RanBP1在有丝分裂结束后核重组中的作用

有丝分裂开始和有丝分裂过程的进行依赖于细胞形态和组织结构的显著变化，包括核膜破裂和染色体凝集。相反，有丝分裂后期的核重建要求染色体解聚，核膜重新组装和通过核膜的转运恢复。Ran在这些事件中起到重要作用，而RanBP1的负调节破坏它们的进行。

RanBP1在哺乳动物细胞中过表达，除了扰乱有丝分裂之外，也产生形态异常的核和染色体凝集改变的情况。这些核表达与MPM2抗体反应的有丝分裂磷酸化抗原决定基有关，而且通常排列成对，是异常的有丝分裂产物的代表。核异常情况包括均质的固缩染色质、有超浓缩斑点和边缘不规则的核，以及不正常重组的核膜。核缺陷的细胞中突变型NES的过表达、输出缺陷和RanBP1的产生更明显。因此，异常高浓度的RanBP1持续存在，尤其是错误地定位于细胞核时会影响核的重建。这些结果表明，在细胞有丝分裂期到间期转换时，Ran-BP1的水平下调对染色质浓缩和功能性间期核重组来说是必要的[11]。

在哺乳动物细胞中，在有丝分裂结束后Ran-BP1的消失可能是一个间期核形成开始的关键信号。正如上面所论述的，RanBP1转染细胞在有丝分裂结束时RanBP1持续高水平表达，染色质去凝集失败，也不能重组正常的核膜，这至少说明，RanGTP是活体内需要的，与过量的RanT24N的爪蟾体系中看到的有缺陷的重构核是一样的。在RanBP1过表达的末期细胞中，没有抑制Ran在细胞核中的重新定位，但出现了有丝分裂出口的不完善和间期核结构的重建失败，进一步反映Ran的功能被抑制。

[1]曹允考,张贵学,陈大元,等.GTPaseRan及其生物学作用[J].细胞生物学杂志,2004,6(3):241-246.

[2]Bressan A,Somma M P,Lewis J,et al.Characterisation of the opposite-strand genes from the mouse bidirectionally transcribed Htf9 locus[J].Gene,1991,103:201-209.

[3]Bischoff F R,Krebber H,Smirnova E,et al.Co-activation of Ran-GTPase and inhibition of GTP dissociation by RanGTP binding protein RanBP1[J].EMBO J,1995,1:705-715.

[4]Di Matteo G,Salerno M,Guarguaglini G,et al.Interactions with single-stranded and double-stranded DNA-binding factors and alternative promoter conformation upon transcriptional activation of the Htf9-a/RanBP1 and Htf9-c genes[J].J Biol Chem,1998,273:495-505.

[5]Guarguaglini G,Renzi L,Ottavio F,et al.Regulated Ran-binding protein 1 activity is required for organization and function of the mitotic spindle in mammalian cells in vivo[J].Cell Growth Differ,2000,11:455-465.

[6]Di Fiore B,Guarguaglini G,Palena A,et al.Two E2F-binding sites independently control growth-regulated and cell-cycle regulated transcription of the Htf9-a/RanBP1 gene[J].J Biol Chem,1999,274:10339-10348.

[7]Plafker K,Macara I G.Facilitated nucleocytoplasmic shuttling of the Ran binding protein RanBP1[J].Mol Cell Biol,2000,20:3510-3521.

[8]Di Fiore B,Ciciarello I,Iangiacasale R,et al.Mammalian RanBP1 regulates centrosome cohesion during mitosis[J].J Cell Sci,2003,116:3399-3411.

[9]Tedeschi A,Ciciarello M,Manqizcasale R,et al.RanBP1 localizes a subset of mitotic regulatory factor on spindle microtubules and regulateschromosomesegregationinhumancells[J].J Cell Sci,2007,120:3748-3761.

[10]Rensen W M,Roscioli E,Tedeschi A,et al.RanBP1 downregulation sensitizes cancer cells to taxol in a caspase-3-dependent manner[J].Oncogene,2009,10:1038-1039.

[11]Baumer M,Kunzler M,Steigemann P,et al.Yeast Ran-binding protein Yrb1p is required for efficient proteolysis of cell cycle regulatory proteins Pds1p and Sic1p[J].J Biol Chem,2000,275:38929-38937.