超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中18种生物碱及风险评估

刘先军，冯家力，曾 栋，陈东洋，李帮锐，张 昊，梁 静，罗 波

（湖南省疾病预防控制中心，湖南 长沙 410003）

中医学将按照传统既是食品又是中药材的物质称为“药食同源”物质［1］。根据国家卫生健康委员会公布的名单，约有110 种药食同源物质，蜂蜜是其中一种。随着蜂蜜需求量的不断提高，其安全问题受到广泛关注［2］。现有研究主要关注蜂蜜的农药、兽药残留［3-4］或外源性掺假、掺杂［5］等，对内源性的污染关注不多。有些植物的花蜜、花粉和种子会产生对人类和动物有毒性作用的生物碱，如不仅有肝毒性，还具有遗传毒性和致癌性的吡咯里西啶类生物碱（PAs）［6］；对血液系统和生殖系统有毒副作用的雷公藤类化合物［7］；可引起兴奋、痉挛等中毒症状的马桑类化合物［8］；还有可引起溶血性贫血导致黄疸的异喹啉类化合物小檗碱［9］。这些生物碱通过污染茶叶、草药、饲料等对人畜造成毒害［10-11］。蜜蜂采集花蜜或花粉的区域面积平均约为7 km2［12］，鉴于自然环境中植物的多样性，该范围内可能存在多种含有毒生物碱的植物，因此蜂产品可能受到有毒生物碱的污染。目前《澳新食品标准法典》［13］关于蜂蜜中有毒生物碱的限量，仅规定了羟基马桑毒素的限量（2 mg/kg），欧盟修订条例（EC）No.2020/2040［14］也只设定茶叶和调味茶中的PAs 限量为150 μg/kg，尚未对蜂蜜中有毒生物碱制定限量标准。因此建立一种准确、灵敏的蜂蜜中生物碱检测方法，对评估国内市场蜂蜜产品的健康安全风险具有一定意义。

目前主要采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术分析蜂蜜中生物碱［15-16］，该技术特异性强、灵敏度高，是现阶段痕量分析的重要手段。采用液相色谱-串联质谱法进行定量测定时，会受到与目标化合物同时提取的其他物质的干扰，影响目标化合物的离子化效率。为确保分析的准确性，通常需要优化前处理方法以降低背景干扰、减少基质效应，如采用液-液萃取、固相萃取（SPE）、基质分散固相萃取（QuEChERS）等技术。目前文献中蜂蜜样品净化方法多采用SPE［15-17］和QuEChERS 技术［18-20］，但对有毒生物碱的检测主要集中在PAs类［10-11，15-17，20］，雷公藤类、马桑内酯和异喹啉类较少检测［12，19］，同时检测蜂蜜中两类以上生物碱的方法目前很少［12］。因此本实验选取7 种PAs 和7 种雷公藤类化合物、3 种马桑内酯和异喹啉类荷叶碱共18种有毒生物碱作为研究对象，采用MCX 固相萃取和超高效液相色谱-串联质谱技术建立了蜂蜜中多种有毒生物碱的检测方法，并根据实际样品检测结果开展风险评估，为蜂蜜的用药和膳食安全评估提供技术手段和科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-Xevo®- TQ-S质谱仪（美国Waters公司）；MassLynx V4.1工作站；Oasis MCX 固相萃取柱（150 mg/6 mL，美国Waters 公司）。甲醇（HPLC 级，德国Merck 公司）；甲酸（纯度为99%，德国Fluka 公司）；除特别说明，其他试剂均为分析纯。克氏千里光宁、千里光菲林、兰蓟定（纯度≥98%，德国Phytolab 公司），倒千里光碱、千里光宁、野百合碱、马桑亭、马桑宁、羟基马桑内酯、雷公藤次碱、雷公藤定碱、雷公藤甲素、雷公藤吉碱、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、石松胺、荷叶碱（团队实验室提供［12］，纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）。40份蜂蜜样品，购于当地超市和零售店。

1.2 样品前处理

1.2.1 试样制备称取均质蜂蜜样品2.00 g 置于50 mL 聚四氟乙烯离心管中，加入15 mL 0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀1 min，超声提取15 min后，于4 ℃ 以10 000 r/min离心3 min。取上清液待净化。

1.2.2 净 化MCX 柱先用5 mL 甲醇、5 mL 水、5 mL 0.1%甲酸水溶液活化，将上述待净化的样品制备液过柱，弃去滤液，依次用5 mL 水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱后吹干，用1.0 mL 0.1%甲酸水溶液复溶，涡旋混合后，过 0.2 μm滤膜，供测定。

1.3 色谱分离条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH Phenyl柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色谱柱温度：40 ℃；进样室温度：4 ℃；进样体积：5 μL。流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为甲醇，流速0.3 mL/min。流动相洗脱梯度：0～3 min，5%～15% B；3～5 min，15%～25% B；5～5.5 min，25% B；5.5～7 min，25%～62% B；7～10 min，62%～100% B；10～11 min，100% B；11～11.1 min，100%～5% B；11.1～13 min，5%B；与团队前期研究数据基本一致［12］。

1.4 质谱检测条件

离子源：电喷雾电离源（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气流速：1 000 L/h；脱溶剂气温度：550 ℃；碰撞气流速：0.12 mL/min。18种生物碱的质谱采集参数见表1。

表1 18种生物碱的质谱采集参数Table 1 Mass acquisition parameters for 18 alkaloids

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

生物碱是弱碱性物质，在酸性溶液中易于解离提取。有文献报道选择0.05 mol/L 硫酸溶液作为提取溶剂［13］。本实验对比了0.05 mol/L 硫酸溶液和0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂对目标物回收率的影响，结果显示两者无明显差异，因此选择0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂。考察了提取溶剂体积（10、15、30 mL）对基质提取效果的影响，结果表明，提取溶剂体积为15 mL 时目标物的回收率高，同时能节省净化时间。

本实验采用MCX 固相萃取柱对蜂蜜样品中目标生物碱进行富集与净化［13-15］，MCX 固相萃取柱的双重保留模式（离子交换与反相保留）能在复杂基质中最大限度地保留目标化合物。预实验过程中发现目标生物碱的保留受到淋洗液甲醇浓度的影响，因此考察了淋洗液中甲醇浓度对目标生物碱保留的影响。依次吸取5 mL 不同体积分数甲醇水溶液（0%、5%、10%、25%、50%、75%和100%）洗脱已上样的MCX柱，结果显示甲醇体积分数为0%、5%时，无目标化合物流出；体积分数为10%时，流出物中含少量马桑宁和羟基马桑内酯；体积分数为25%时，流出物新增少量马桑亭；体积分数为50%时，流出物新增雷公藤甲素；体积分数高于75%时，流出物包含大量马桑亭、马桑宁、羟基马桑内酯、雷公藤甲素、雷公藤内酯酮和雷酚内酯。可能是因为上述生物碱仅靠范德华力在反相固相萃取柱上保留，因其极性较强，容易被甲醇洗脱［21］。

实验中增加有机溶剂淋洗步骤以最大限度除去杂质，降低基质效应（ME）。采用下式计算基质效应：ME=基质匹配溶液响应/溶剂标准溶液响应×100%，ME=1时，表明无基质效应；ME ＜1，为基质抑制效应；ME ＞1，为基质增强效应。用阴性洋槐蜂蜜样品提取液过MCX 萃取小柱，经5%甲醇水淋洗，氨化甲醇洗脱氮吹后复溶制备成标准曲线的稀释溶液，使标准工作溶液和样品溶液的基质相同，上机分析。结果发现，除雷公藤内酯酮的基质效应接近50%，其他17 种生物碱的基质效应为70%～99.8%，基本满足食品中痕量污染物分析的要求。鉴于蜂蜜品种繁多，基质不一，比较了常见的洋槐蜂蜜与紫云英蜂蜜基质对目标分析物的影响，结果显示两者间无明显差异。因此本前处理方法适合蜂蜜中多种生物碱的提取和净化。

根据以上结果，本实验采用15 mL 0.1%甲酸水溶液提取，MCX 小柱净化，5 mL 5%甲醇水溶液淋洗作为前处理条件。

2.2 色谱与质谱条件的优化

由于生物碱有含氮杂环结构，N 原子上有孤对电子，与质子结合呈弱碱性，酸性条件下易与氢离子形成［M+H］+分子离子峰，因此本实验在ESI+MRM 模式下优化各种质谱参数，以获得最大灵敏度。考察了反相色谱常用的流动相体系甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水对目标物色谱行为的影响，结果发现，以甲醇-0.1%甲酸水作为流动相时可获得更好的响应和峰形。此外，还比较了待测物在Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和BEH Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱上的分离效果，发现雷公藤类化合物在Phenyl柱上的响应和峰形优于C18柱。这可能是因为Phenyl柱含有三键键合的苯己基配体，对含有芳香环的分析物具有更好的选择性，能提供更优异的峰形。因此选择BEH Phenyl柱作为色谱分析柱。在优化条件下，18种生物碱标准溶液的MRM图见图1。

图1 18种生物碱标准溶液的定量离子MRM图谱Fig.1 Quantitative ion MRM chromatograms of 18 alkaloids mixed standard solution

2.3 线性范围、检出限与定量下限

采用阴性蜂蜜样品按照实验步骤制备成标准稀释液，加入适量标准储备液配成不同质量浓度的基质匹配溶液，采用本方法进行测定。以定量离子的峰面积（y）对相应的质量浓度（x，μg/L）进行线性回归分析。结果显示，所有目标生物碱在对应质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.993；方法定量下限（LOQ，S/N=10）为0.05～25 μg/kg（表2）。

表2 蜂蜜中18种生物碱的线性范围、回归方程、相关系数与定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations，r2 and limits of quantitation for 18 alkaloids in honey

2.4 回收率与相对标准偏差

取空白洋槐蜂蜜样品，分别加入低、中、高3 个不同浓度水平混合标准溶液，按最优条件进行处理和测定（表3），得到18种生物碱的平均加标回收率为77.2%～115%，相对标准偏差（RSD）不大于12%，表明该方法的准确度和精密度良好，可用于蜂蜜样品的分析。

表3 蜂蜜中18种生物碱的平均加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 18 alkaloids in honey（n=6）

2.5 实际样品测定

采用本方法对40 份来自不同产地的不同种类国产蜂蜜样品进行检测，其中3 份样品检出石松胺，含量分别为1.09、1.80、5.06 μg/kg；另3份样品检出千里光菲林，含量分别为15.1、18.3、18.7 μg/kg（图2）。石松胺和千里光菲林均属于PAs，该类生物碱全球分布最为广泛，主要集中在菊科和紫草科等，全世界约有3%的有花植物（约6 000种）含有PAs［20］。这可能是PAs易在蜂蜜中检出的原因。

图2 蜂蜜样品中PAs的UPLC-MS/MS色谱图Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of PAs in honey samples

欧洲药品监管局2016 年在关于含PAs 草药污染的风险管理和质量控制中给出的过渡性建议为PAs的推荐每日摄入量应限制在0.35 μg以内［22］。本次所测的40份蜂蜜样品中有6份样品检出PAs，检出率为15%，含量范围为1.09 ～18.7 μg/kg，平均为10.1 μg/kg。参考我国《第五次中国总膳食研究》中北京市人均蜂蜜摄入量数据（2.72 g/人/天），则本次阳性样品含量未超过推荐值（0.35 μg），风险可接受；根据2020 年版《中华人民共和国药典》［23］规定蜂蜜用量为15～30 g，因此阳性样品中平均每日摄入量为0.23 μg（按平均用量22.5 g，平均含量10.1 μg/kg 计算），最高为5.61 μg（按最大用量30 g，含量18.7 μg/kg 计算）。本次有3 份阳性样品含量超过该推荐值。依据我国《食品中农药残留风险评估指南》［24］，对蜂蜜进行残留量膳食风险评估时采用的长期膳食风险和短期膳食风险模型中推荐的长期蜂蜜摄入量和短期蜂蜜摄入量（分别为40 g/人/天和100 g/人/天），则这6 份阳性样品中长期膳食暴露风险和短期膳食风险分别有3 份（含量分别为0.604、0.732、0.748 μg）和4份（含量分别为0.506、1.51、1.83、1.87 μg），其中1 份同时具有长期和短期暴露风险。鉴于蜂蜜是高频消费的药食同源产品，其低水平、长期暴露的风险值得关注。

3 结 论

本研究利用0.1%甲酸水溶液提取蜂蜜样品中的生物碱，采用MCX 固相萃取柱富集与净化，UPLC-MS/MS 同时检测蜂蜜中马桑内酯、雷公藤类、异喹啉类和吡咯里西啶类等18种生物碱，方法准确度和精密度良好。采用该方法对40 份蜂蜜样品进行检测，检出石松胺和千里光菲林2 种吡咯里西啶类生物碱。初步风险评估显示，蜂蜜作为药食同源产品，具有一定的膳食风险。