超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中15种N-亚硝胺化合物

汪 毅，梁文耀，何国山，陈张好，周智明，吴 谦，席绍峰，谭建华*

（1.广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量检验检测中心（广州），广东 广州 511447；2.广东省药品检验所，广东 广州 510663）

N-亚硝胺化合物是一类具有N-亚硝基结构的化合物，因取代基的不同，形成了种类繁多的同系物，目前已发现超过300种［1］。N-亚硝胺化合物大多具有致癌性［2］，在饮用水、食品、烟草、化妆品中均有N-亚硝胺化合物检出情况［3-6］，对人体健康构成威胁。我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）［7］与欧盟化妆品法规（EC）No 1223/2009［8］均将N-亚硝胺化合物列入禁用目录，并规定化妆品产品中N-亚硝胺化合物不得超过50 ng/g。化妆品中N-亚硝胺化合物的主要来源为原料直接带入或原料经亚硝化反应产生。

文献报道化妆品中可能检出的N-亚硝胺化合物有N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）、N-亚硝基二甲基胺（NDMA）等［6，9-14］，检测方法主要有气相色谱-热能分析法（GC-TEA）［15］、液相色谱-热能分析法（LCTEA）［16］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［3，5，10，12-14］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）［6，9，11，17］、液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）［4，18］、气相色谱-高分辨质谱法（GC-HRMS）［19］。N-亚硝胺化合物通常痕量存在于化妆品中，对方法的灵敏度要求极高。国家标准GB/T 29669-2013 采用GC-MS/MS 测定10 种N-亚硝胺化合物［20］，但方法的检出限不能满足50 ng/g 的限量要求。另外，由于N-亚硝胺为一大类化合物，物化性质差异很大，现有文献采用LC-MS/MS 技术［3，5，10，12-14］进行测定时主要针对部分性质差异较小的N-亚硝胺化合物，方法所涉及的化合物覆盖范围不足。因此，亟需建立准确、灵敏、覆盖范围广的N-亚硝胺化合物检测方法。

本研究根据15种N-亚硝胺化合物的物化性质和不同化妆品的基质特点，通过系统优化前处理方法和仪器分析条件，最终采用分组提取，结合亚铁氰化钾-乙酸锌溶液沉淀大分子和饱和氯化钠-乙腈盐析等净化方法，解决了部分N-亚硝胺化合物稳定性差、易被干扰且多组分测定时存在的溶剂效应等问题，建立了覆盖化妆品中15种N-亚硝胺化合物的UPLC-MS/MS检测方法。方法的准确度、精密度和灵敏度可满足化妆品中N-亚硝胺化合物的痕量检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SCIEX Triple Quad™ 5500+超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪配有大气压化学电离源（APCI）（美国SCIX 公司）；BSA224S-CW 电子天平（德国赛多利斯公司）；MS3 basic 涡旋振荡器（德国IKA 公司）；KQ-250DV型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司）。

15 种N-亚硝胺化合物对照品和5 种N-亚硝胺化合物同位素内标信息详见表1，质量浓度均为100 μg/mL于甲醇，均购于上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铵、氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用纯水（18.2 MΩ•cm）由Milli-Q纯水系统制备。化妆品的实际样品为市售产品。

表1 N-亚硝胺化合物对照品和同位素内标信息Table 1 Reference materials and isotope internal standard compounds information of N-nitrosamine compounds

（续表1）

1.2 标准溶液的配制

分别准确移取NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA 对照品溶液各100 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用水定容，即得质量浓度为1 000 ng/mL的混合标准溶液（水）；分别准确移取NDELA-D8、NDMA-D6、NPYR-D4、NDEA-D4内标溶液100 μL 于10 mL 棕色容量瓶中，用水定容，配制成质量浓度为1 000 ng/mL的混合内标溶液；用水配制成质量浓度为1、2、5、10、20、50 ng/mL，内标浓度为10 ng/mL 的标准工作溶液（水）。按相同的操作用乙腈配制NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA，内标为NDBA-D18的标准工作溶液（乙腈）。

1.3 样品前处理

1.3.1 水剂样品称取试样约0.5 g（精确至0.000 1 g）于10 mL 具塞比色管中，加入50 μL 混合内标溶液（水），混匀，用水定容至5 mL，超声提取10 min，经微孔滤膜过滤后，滤液作为待测溶液测定NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA。

称取试样约0.5 g（精确至0.000 1 g）于10 mL 具塞比色管中，加入50 μL 内标溶液（乙腈），混匀，用乙腈定容至5 mL，超声提取10 min，经微孔滤膜过滤后，滤液作为待测溶液测定NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA。

1.3.2 膏霜乳液样品称取试样约0.5 g（精确至0.000 1 g）于10 mL 具塞塑料离心管中，加入50 μL混合内标溶液（水），混匀，用水定容至5 mL，超声10 min，加入100 μL 2.5%亚铁氰化钾溶液和100 μL 5%乙酸锌溶液，混匀，静置5 min 后，以5 000 r/min 离心10 min，上清液经微孔滤膜过滤后，滤液作为待测溶液测定NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA。

称取试样约0.5 g（精确至0.000 1 g）于10 mL 塑料离心管中，加入50 μL 内标溶液（乙腈），混匀，加入2 mL 饱和氯化钠水溶液，混匀后，加入5 mL 乙腈，超声提取10 min，以5 000 r/min 离心10 min，上清液经微孔滤膜过滤后，滤液作为待测溶液测定NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA。

1.4 仪器条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司）；流动相：A为0.2 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B为甲醇；梯度洗脱程序：0～2.0 min，2% B；2.0～10.0 min，2%～98% B；10.0～12.0 min，98% B；12.0～12.1 min，98%～2% B；12.1～15.0 min，2% B；流速：0.6 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。电离方式：APCI+；气帘气：0.172 MPa；针电流：3 mA；源温度：450 ℃；喷雾气：0.207 MPa；喷撞气：0.062 1 MPa；扫描模式：多反应监测模式，15种亚硝胺化合物和5种同位素内标的质谱参数见表2。

表2 N-亚硝胺化合物和同位素内标的质谱参数Table 2 MS parameters of N-nitrosamine compounds and isotope internal standards

2 结果与讨论

2.1 质谱参数优化

电喷雾离子源（ESI）一般适用于分子量稍大、极性较强的化合物，大气压化学电离源（APCI）适用于分子量较小、极性稍弱的化合物。本研究的15种N-亚硝胺化合物的分子量和极性差异较大，导致其在ESI和APCI两种离子源的响应有较大差异。由于NDMA、NMEA、NDEA分子量较小且具有一定挥发性，这些化合物在APCI+模式下有较高的响应，但在ESI+模式下响应非常低。对于NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA 等化合物，由于支链的碳链不断加长，分子量变大，在APCI+模式下响应强度低于ESI+，但仍然能够满足灵敏度要求。进一步分析基质加标样品时发现，膏霜乳液类化妆品在ESI+下相比APCI+更易出现基质干扰和抑制，特别是对于出峰时间较慢的NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA 等化合物，其原因可能是因为化妆品中各类高含量表面活性剂等基质所致。因此，本研究选择APCI+模式，并通过进一步优化源温度、喷雾气、针电流参数使15 种N-亚硝胺化合物获得最高的仪器灵敏度。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择考察了Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国赛默飞公司）、Agilent Poroshell Bonus-RP（50 mm×4.6 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司）、Agilent Poroshell SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司）、Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 μm，美国Phenomenex 公司）、Agilent Poroshell SB-Aq 色谱柱（100 mm×3 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司）5 种色谱柱对N-亚硝胺化合物的分离情况。结果显示，化合物在5 种色谱柱上均能实现分离，柱径和填料粒径越小，峰形越尖锐，但柱压越高，其中Aq柱对亲水性化合物保留较好，能使化合物与基质干扰分离。考虑到APCI 需要较高流速，且分离NDELA 和NDMA 需要高比例水相，同时为了减少化妆品基质成分的干扰，最终选用Agilent Poroshell SB-Aq 色谱柱进行分离。

2.2.2 流动相的选择考察了水+甲醇（A）、0.1%甲酸水+甲醇（B）、0.1%甲酸水+0.1%甲酸甲醇（C）、1 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）+甲醇（D）、1 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）+乙腈（E）5 组不同流动相对化合物峰形和响应的影响。结果显示，使用流动相A、B、C 时，15 种N-亚硝胺化合物均能正常出峰，但NDMA、NMEA 和NPYR 检测离子对的基线响应较高，信噪比偏低，灵敏度下降。甲酸的加入能使化合物响应增大，但对基线响应偏高的现象无改善，且多个化合物的基线响应波动增大。使用流动相D 时，乙酸铵的加入明显降低基线响应和改善峰形，但同时也会抑制部分化合物的电离，降低响应，但总体来说提高了信噪比，特别是提高了NDMA、NMEA 和NPYR 的信噪比。流动相E 用乙腈代替甲醇作为有机相，峰形变得更尖锐，但所有化合物的响应明显降低。分析其原因可能是在APCI+模式下，甲酸的加入能提供H+质子，有助于化合物电离的同时也提高了背景化合物的响应。乙酸铵的加入，使得流动相离子强度增加，电子转移速率增加，目标化合物和背景化合物同时抑制电离，乙酸铵在一定浓度下，可提高目标化合物的信噪比。

在流动相D 的基础上进一步对比了不同乙酸铵浓度（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）对化合物峰形及响应的影响。结果显示，随着乙酸铵浓度的增大，基线响应降低，0.5 mmol/L时基线响应达到最低，继续增大乙酸铵浓度，对基线影响不明显。化合物响应则随乙酸铵浓度的增大而降低，NMOR 较为明显。为了兼顾基线响应和化合物响应，达到最优信噪比，最终选取0.2 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）+甲醇作为流动相。优化条件下15 种N-亚硝胺化合物和5 种同位素内标的提取离子流色谱图见图1。

图1 15种N-亚硝胺化合物和5种同位素内标提取离子色谱图Fig.1 Extraction ion chromatograms of 15 N-nitrosamine compounds and 5 isotope internal standards

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取方式的优化15 种N-亚硝胺化合物的性质差异较大，logKow 从-1.28 到7.07，可溶于甲醇、乙腈等有机溶剂且部分可溶于水。实验首先考察了不同上机溶液（纯水、10%～90%甲醇水、10%～90%乙腈水、甲醇和乙腈）对溶剂效应的影响。结果显示，NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA 这8种脂溶性较低的N-亚硝胺化合物对上机溶液较为敏感，溶剂效应较强，有机相比例增大时，峰形严重展宽。同时，随着有机相比例增大，脂溶性较强的NDiNA 响应逐步提高，原因可能是由于有机相比例提高，增大了溶解度，使其响应提高（见图2）。因此，由于溶剂效应和溶解度的双重影响，本研究中的15种N-亚硝胺化合物很难选取同一种上机溶液。

图2 不同上机溶液中N-亚硝胺化合物的提取离子色谱图Fig.2 Extraction ion chromatograms of N-nitrosamine compounds in different solutions

为避免溶剂效应，实验进一步以乙腈为提取溶剂，考察增加氮吹、复溶的方式对N-亚硝胺化合物加标回收率的影响。结果显示，15 种化合物的加标回收率均小于80%，分子量较小的NDMA、NMEA、NDEA等的回收率甚至低于50%。进一步研究发现，即使严格控制温度、避光和氮气流量条件，氮吹过程中N-亚硝胺化合物仍有较大损失，说明该类化合物的稳定性较差。因此整个实验过程应避免使用氮吹处理。如果采用纯水对提取液稀释的方式降低溶剂效应，上机溶液中乙腈的比例需稀释至低于20%，但该操作将方法检出限提高了5倍，无法满足50 ng/g的法规限量要求。因此，本研究将15种N-亚硝胺化合物根据极性大小分为两组，第一组为NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA，第二组为NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA，分别用水和乙腈进行提取。

进一步实验发现，对于第一组化合物采用水作为提取溶剂，膏霜、乳液样品含较多脂质和增稠剂，提取后难于过滤，水剂基质则能很好实现提取和过滤。而在膏霜、乳液基质提取液中加入亚铁氰化钾-乙酸锌溶液沉淀大分子，离心后，可顺利完成过滤操作。该条件下，NDELA 等8 种N-亚硝胺化合物的加标回收率均大于85%，且上机测定时色谱峰形尖锐。对于第二组化合物直接采用乙腈进行提取，但部分膏霜样品因含有高含量的表面活性剂等，造成较为严重的基质干扰。采用饱和氯化钠-乙腈盐析萃取法能大大降低基质效应，NMPhA等7种N-亚硝胺化合物的加标回收率均在85%以上。

2.3.2 提取时间的优化选取超声提取方式进行样品的前处理，并考察了不同超声时间（5、10、15、20 min）对化合物的提取效果（见图3）。结果显示，超声时间达到10 min 时，15 种N-亚硝胺化合物的加标回收率均可达到85%以上，进一步延长超声时间对提取效果影响不大，但在超声时间达到20 min 时部分N-亚硝胺的回收率呈下降趋势，可能是发生了降解转化所致。因此本研究选取10 min 作为最佳超声提取时间。

图3 超声时间对15种N-亚硝胺化合物回收率的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on the spiked recoveries of 15 N-nitrosamine compounds

2.3.3 固相萃取净化效果的考察采用固相萃取的净化方式考察了Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Waters Oasis WCX（60 mg，3 mL）、Waters Oasis MCX（60 mg，3 mL）（美国沃特世公司）和CNW C18（60 mg，3 mL，上海安谱公司）4 种萃取小柱对N-亚硝胺化合物的加标回收率。结果显示，使用HLB 和C18小柱时，过柱和氮吹等操作导致部分化合物损失严重，且强极性的NDELA和NDMA在固相萃取小柱上保留较弱，导致直接流出，回收率低于10%；而NDiNA 在小柱上保留过强，难于洗脱，使得回收率偏低。使用WCX 和MCX 时，上样和洗脱需用氨水和甲酸调节pH 值，由于N-亚硝胺化合物对酸碱较敏感，操作过程中导致化合物降解，回收率无法达到理想效果。因此，本研究最终未采用固相萃取的净化方式，而是通过“2.3.1”对提取方式进行系统优化以提升方法的准确性和精密度。

2.4 线性关系、方法检出限与定量下限

按“1.4”仪器条件，将质量浓度为1、2、5、10、20、50 ng/mL，内标浓度为10 ng/mL 的标准工作溶液由低到高进行测定。以标准溶液浓度与同位素内标浓度之比为横坐标，对应的峰面积与同位素内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程和相关系数，所有化合物在相应质量浓度范围内均呈现良好线性，相关系数（r2）均大于0.995。分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）计算方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。表3 列出了15 种N-亚硝胺化合物的线性方程、相关系数、方法检出限和定量下限。

表3 15种N-亚硝胺化合物的线性回归方程、相关系数（r2）、方法检出限及定量下限Table 3 Linear regression equations，correlation coefficients（r2），detection limits and quantitation limits of 15 N-nitrosamine compounds

（续表3）

2.5 回收率与相对标准偏差

平行称取3 种空白基质（水剂、乳液、膏霜）样品各6 份，每份约0.5 g，共3 组，分别加入适量混合标准溶液和内标溶液，使得加标水平分别为25、50、100 ng/g（1/2倍限量值、限量值、2倍限量值），按“1.3”处理后进行测定，15种N-亚硝胺化合物的加标回收率与相对标准偏差（RSD）结果见表4。从表中可以看出，3 种基质在不同加标浓度下化合物的平均回收率为88.0%～111%，RSD 为1.4%～9.8%。结果显示，该方法准确可靠，精密度高。

表4 15种N-亚硝胺化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 15 N-nitrosamine compounds（n=6）

（续表4）

2.6 实际样品测定

收集水剂、乳液、膏霜等类型市售化妆品样品71 批次，采用本方法对15 种N-亚硝胺化合物进行测定。检测结果见表5。13 批次样品检出NDELA，其中12 批次均小于限量值50 ng/g，1 批次洁面泡泡样品中检出705 ng/g的NDELA，超出限量值。化妆品样品中常检出NDELA，这与化妆品较多使用三乙醇胺（TEA）相关原料有关。分析NDELA 超限量值样品的配方表，发现其使用月桂醇硫酸酯TEA盐作为原料，此原料可能带入NDELA，导致其超过限量值，建议加强原料的质量控制。

表5 市售样品中N-亚硝胺化合物的检测结果Table 5 Test results of N-nitrosamine compounds in commercially available samples

3 结 论

本研究通过优化质谱参数和超高效液相色谱条件，调整前处理方法以及采用同位素内标等方式，建立了UPLC-MS/MS测定化妆品中15种N-亚硝胺化合物的分析方法。方法针对性较强、测定结果准确可靠，检出限满足相关限量要求，适用于化妆品中15种N-亚硝胺化合物的痕量测定。该方法有效弥补了现有标准方法的不足，通过对市售化妆品的检测，发现NDELA常检出且存在超限量值情况。本方法的建立将为化妆品中N-亚硝胺化合物的监测和风险评估提供更多的技术手段，为化妆品监管和产品质量控制提供重要的技术支撑。