QuEChERS/高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法测定巧克力中的18种合成大麻素

史洪飞，徐伯芃，徐成鑫，周修齐，张吕悦，张玉曼，冶 金，刘 畅

（南京警察学院 刑事科学技术学院，江苏 南京 210023）

合成大麻素是一类新精神活性物质，其与四氢大麻酚类天然大麻素的作用机理相似，通过与大麻素受体结合发挥作用，且精神活性作用更强［1］。长期吸食合成大麻素会对大脑、肝脏、心血管系统产生严重损伤，引发精神错乱等多种疾病［2-3］。合成大麻素种类较多，根据其化学结构特征可分为天然大麻素类似物、吲哚类、吲唑类、4-氮杂吲唑类、苯并咪唑类、茚类、咔唑类、吡咯类、吡唑类［4-6］。中国裁判文书网相关数据显示，2017 至2022 年，全国共破获151 起合成大麻素类涉毒案件（电子烟油90起、香草烟丝58 起、胶囊药物2 起、饮料1 起），82 份明确说明合成大麻素种类的判决文书中77 份为吲唑类合成大麻素、7 份为吲哚类合成大麻素。吲唑和吲哚类合成大麻素是目前主要的涉案类型，电子烟油和香草烟丝为主要的添加基质，饮料、巧克力和软糖等食品则涉案较少。近年来公安机关对含有合成大麻素的电子烟油和香草烟丝的打击力度不断加强，同时《电子烟管理办法》的推行限制了调味电子烟和可自行添加雾化物电子烟的销售，大大提高了通过电子烟和香草烟丝伪装贩卖毒品的风险。巧克力等由于便于携带、口感较好，深受大众喜爱，市场流通量较大，为毒品提供了良好的隐藏环境。2021～2022年国家林业局司法鉴定中心共受理6起巧克力、软糖基质中添加大麻素的案件。巧克力等食品可能成为未来合成大麻素添加的一类常见基质［7-9］。

目前，检测合成大麻素的方法主要有差分拉曼光谱法［10-12］、气相色谱-质谱法［8，13-19］、气相色谱-串联质谱法［20］、液相色谱-串联质谱法［21-37］、胶束毛细管电动色谱法［38］；研究的样品基质有食品［8，36］、电子烟油［13-15，21］、香草烟丝［18-20，32-33］、血液［23-25］、毛发［26-30］、口腔液［31］、尿液［35］。合成大麻素的提取检测研究基质多集中于生物检材、电子烟油和香草烟丝，对于食品方面的研究较少。于聪聪等［7］利用甲醇直接提取基于液相色谱-串联质谱法检测黑巧克力中的5种天然大麻素，该方法分析速度快，但提取液中存在较多杂质，易对离子源造成污染，且基质效应较强，影响定量分析的准确性；唐庆强等［8］选择猪肉、牛奶、橄榄油、蜂蜜、面包、茶叶、大豆、可乐饮料和啤酒为检材，利用固相萃取法净化、氮吹浓缩后基于气相色谱-质谱法对6 种合成大麻素和3 种天然大麻素进行检测，方法平均回收率为65.2%～117.9%；邵曼等［37］基于高效液相色谱-串联质谱法对巧克力、软糖、饼干、饮料、糕点、白酒中的8种天然大麻素进行检测，选择增强型脂质去除净化剂（EMR-Lipid）净化样品，有效去除了巧克力中的脂质和软糖中的胶质，并通过向提取液中添加10%的丙三醇甲醇溶液优化了氮吹浓缩条件，有效去除了杂质成分，方法平均回收率为89%～101%。

本文基于QuEChERS/高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法，建立了巧克力中18种吲哚类和吲唑类合成大麻素的检测方法，并探讨了实验过程中合成大麻素同分异构体的分辨问题，为巧克力产品的安全监管及风险防范提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱级，美国 Thermo Fisher 公司）；PSA 净化剂、C18净化剂（40～60 μm，青岛邦凯高新技术材料有限公司）；黑巧克力（市售）。

18 种合成大麻素：5F-ADBICA、4F-MDMB-BUTICA、AMB-FUBICA、5F-MDMB-PICA、5FEMB-PICA、 MDMB-FUBICA、 5F-EDMB-PICA、 ADB-FUBINACA、 ADB-BUTINACA、 ADB-4en-PINACA、4F-MMB-BUTINACA、4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-EMB-PINACA、5FADB、MDMB-FUBINACA、MDMB-4en-PINACA、4F-ABUTINACA（99.9%，0.1 mg/mL，均由公安部物证鉴定中心提供）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290-6545 高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪配电喷雾双喷离子源（Dual AJS ESI，美国Agilent公司）；ME104E 电子天平（精确至0.1 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Lab Dancer涡旋振荡仪（德国IKA公司）；Pico17微量高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司）。

1.3 标准溶液配制

混合标准储备溶液：精密移取18种合成大麻素的单个标准溶液各0.1 mL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀制成1 mg/L的混合标准储备溶液。

系列混合标准工作溶液：精密移取18种合成大麻素的混合标准储备溶液，用甲醇将其稀释成质量浓度为1、5、10、25、50、75、100、150、200 μg/L的合成大麻素系列混合标准工作溶液。

1.4 加标样品的制备

用小刀将巧克力切碎后称取200.0 mg于2 mL 聚丙烯离心管中，分别精密移取10、20、30 μL 混合标准储备溶液于巧克力中，50 ℃超声水浴15 min 使巧克力融化并与合成大麻素充分混合，于2 ℃冷藏凝固为块状，制备18种合成大麻素加标量分别为50、100、150 μg/kg的巧克力样品。

1.5 实验条件

1.5.1 样品前处理条件取离心试管中的巧克力样品，用小刀切碎后，装回该离心试管中，加入1 mL甲醇，涡旋振荡2 min，在50 ℃下超声提取10 min，再次涡旋振荡2 min，以10 000 r/min离心3 min；取600 μL 上层清液于2 mL 微量离心管中，加入C18和PSA 净化剂各0.05 g，涡旋振荡3 min，以10 000 r/min离心3 min，取上层清液过0.22 μm滤膜，移至进样瓶中待测。

1.5.2 色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈；进样量为5 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～2.0 min，10% ～65% B；2.0～6.0 min，65% B；6.0～7.0 min，65% ～90% B；7.0～9.0 min，90% B；9.0～9.5 min，90% ～10% B；9.5～11.0 min，10% B。

1.5.3 质谱条件离子源：Dual AJS ESI 源，正离子模式；毛细管电压：4 000 V；诱导解离电压：160 V；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：11 mL/min；干燥气温度：320 ℃；干燥气流速：8 mL/min；一级质谱数据采集为单级质谱全扫描模式（MS），扫描范围为m/z100～600，采集速率为5 spectra/s。二级质谱数据采集为目标离子采集模式（Target MS/MS），一级质谱扫描范围为m/z100～600，采集速率为1 spectra/s，二级质谱扫描范围为m/z50～600，采集速率为4 spectra/s。采用参比离子（C5H4N4，嘌呤，其准分子离子精确质量数为121.050 9）实时质量校准。18种合成大麻素的保留时间、母离子精确质量数、子离子精确质量数等见表1。

表2 18种合成大麻素的回归方程、线性范围、相关系数、检出限与定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，r2，limits of detection and limits of quantitation of 18 synthetic cannabinoids

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

合成大麻素的种类较多，互为同分异构体的合成大麻素在色谱保留和质谱碎片方面十分相似，检验认定存在一定困难。实验通过色谱保留时间和二级质谱碎片实现了5F-EMB-PICA 与5F-MDMBPICA和5F-EMB-PINACA 与5F-ADB两对同分异构体的区分。

2.1.1 色谱条件的优化对比了Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）和Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）两种色谱柱对18 种合成大麻素的分离效果。结果显示，后者对合成大麻素的保留相对较强，但二者的选择性无显著差异，因此选择出峰速度较快且应用更广泛的C18色谱柱。通过优化流动相流速（0.3、0.35、0.4 mL/min）、流动相种类、梯度洗脱条件和柱温箱温度（30、40、50 ℃）成功将同分异构体5F-EMBPICA 与5F-MDMB-PICA 分离，其保留时间分别为5.15 min 和5.32 min，另一对同分异构体5FEMB-PINACA 与5F-ADB 在上述条件下均未实现分离。18 种合成大麻素的提取离子色谱图见图1。

图1 18种合成大麻素的提取离子色谱图Fig.1 Extraction ion chromatograms of the 18 synthetic cannabinoids the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.1.2 质谱条件的优化毛细管出口区域的碰撞诱导解离电压对目标化合物准分子离子的响应影响较强，过高或过低均不利于提升方法灵敏度。碰撞诱导解离电压过高时目标化合物易发生源内裂解，过低时化合物准分子离子的离子传输效率降低。本研究在MS采集模式下，考察了碎裂电压在110～170 V范围内18种合成大麻素准分子离子峰的响应情况，确定最佳碰撞诱导解离电压为160 V。

在Target MS/MS 采集模式下调整碰撞能量，选取响应最强的子离子为定量离子，响应较强的离子为定性离子。优化碰撞能量，使定量离子的响应达到最强，确定18 种合成大麻素的最佳质谱参数如“1.5.3”所示。

2.1.3 同分异构体的分辨通过二级质谱碎片离子，能分辨未实现色谱分离的同分异构体 5F-EMBPINACA（二级质谱主要碎片离子为m/z233.107 5、304.181 6和332.177 0）与5F-ADB（二级质谱主要碎片离子为m/z233.107 5、318.197 3 和346.192 1），利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 软件中的精确质量计算器，算得离子分子式分别为［C17H23FN3O］+、［C18H23FN3O2］+和［C18H25FN3O］+、［C19H25FN3O2］+，据此推断5F-EMB-PINACA 与5F-ADB 的质谱裂解方式见图2A和图2B。参照二者的质谱裂解方式，可知另一对同分异构体5F-EMB-PICA 与5F-MDMB-PICA 亦存在相似的质谱裂解过程，除主要碎片离子m/z232.112 5 外，分别发现少量碎片离子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8，减小碰撞能，碎片离子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8 的响应无显著上升。利用精确质量计算器计算，离子分子式分别为［C18H24FN2O］+、［C19H24FN2O2］+和［C19H26FN2O］+、［C20H26FN2O2］+，推断5F-EMB-PICA 与5F-MDMB-PICA 的质谱裂解方式见图2C 和图2D。两对同分异构体的中心母体结构不同，实验发现5F-EMB-PICA 的碎片离子m/z303.187 8、331.179 9 与5FMDMB-PICA 的碎片离子m/z317.202 1、345.195 8 稳定性较差，更易直接生成相同的碎片离子m/z232.112 5，两者的质谱特征差异不明显，可采用色谱保留时间结合二级质谱碎片的方式进行分辨。

图2 4种合成大麻素的二级质谱图及质谱裂解方式Fig.2 Secondary mass spectra and fragmentation pathways of the four synthetic cannabinoids

2.2 样品提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化分别以1 mL甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，体积比）、甲醇-水（1∶1，体积比）、乙腈-水（1∶1，体积比）为提取溶剂，对0.2 g 巧克力样品于50 ℃超声提取15 min 后振荡提取2 min；以10 000 r/min离心3 min后取上层清液过滤膜直接进样。以母离子提取离子色谱图的色谱峰面积为评价指标确定最优提取溶剂，结果如图3所示。

图3 提取溶剂对巧克力中18种合成大麻素提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction solvents on the extraction effects of 18 synthetic cannabinoids in chocolate

结果显示，除4F-ABUTINACA 外，其他合成大麻素以甲醇为提取溶剂时的提取效果较好，可能是由于4F-ABUTINACA 的甲酰胺上连接的取代基为金刚烷，使其与其他取代基为酯基和氨酰基的合成大麻素在溶解性方面存在较大差异，更适合用极性较弱的乙腈进行提取。由于本实验的目标物多为酯基和氨酰基类合成大麻素，因此选择甲醇作为提取溶剂。

2.2.2 超声提取条件的优化巧克力中可可脂的熔点约为34～38 ℃，因此选择超声温度为50 ℃，以甲醇为提取溶剂分别超声提取10、20、30 min，以母离子提取离子色谱图的色谱峰面积为评价指标确定最佳提取时间。结果显示，超声提取时间对样品提取效果的影响较小，为缩短前处理时间、减少杂质溶出，选择样品超声提取时间为10 min。

2.3 净化条件的优化

实验考察了2 ℃冷藏保存12 h 后10 000 r/min 离心3 min 的方法对巧克力甲醇提取液的净化效果，发现该方法能有效沉淀去除脂质等部分杂质，但耗时较长且无法实现色素成分的去除。因此实验采用QuEChERS 前处理方法中的净化方式，选择PSA 和C18净化剂对样品中的极性和非极性杂质进行去除，通过提取液颜色和2 ℃冷藏保存12 h 后离心观察是否有沉淀产生，判断样品中脂质、糖类等成分的去除情况，结合加标回收率确定净化剂的添加量。结果表明，单独添加0.01、0.02、0.05 g PSA 进行净化时，18 种合成大麻素的回收率分别为131%～146%、115%～127%和107%～125%；PSA 能有效去除样品中的色素等极性成分，但无法去除脂质等非极性成分，冷藏后溶液有部分沉淀析出。单独添加0.01、0.02、0.05 g C18进行净化时，18 种合成大麻素的回收率分别为130%～142%、119%～129%和98.4%～117%；C18能有效去除样品中的脂质等非极性成分，冷藏后溶液澄清，但无法有效去除色素。同时添加C18和PSA 净化剂各0.01、0.02、0.05 g 进行净化时，18 种合成大麻素的回收率分别为121%～134%、110%～124%和90.6%～107%；添加C18和PSA 净化剂各0.05 g 能够有效去除色素等极性成分和脂质等非极性成分，且提取回收率较高。因此选择净化剂C18和PSA各0.05 g。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性及灵敏度采用本方法检测系列混合标准工作溶液，以化合物的响应为纵坐标（y），对应质量浓度为横坐标（x）绘制工作曲线。18 种合成大麻素均在1～200 μg/L 范围内呈良好线性关系，相关系数不小于0.997 0，满足定量分析要求。分别以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）确定化合物的检出限（LOD）与定量下限（LOQ），得到18种合成大麻素的检出限和定量下限分别为0.02～0.20 μg/L和0.07～0.66 μg/L。

2.4.2 准确度与精密度采用本方法对空白巧克力样品进行50、100、150 μg/kg 3 个水平的加标实验，每种样品平行3份，每个平行样品进样2次，计算方法回收率和相对标准偏差（RSD）。18种合成大麻素的回收率为86.2%～104%，RSD为0.070%～2.0%（见表3），表明该方法具有良好的准确度。

表3 18种合成大麻素的回收率与相对标准偏差（%）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18 synthetic cannabinoids（%）

分别对同一瓶提取液进行6次连续进样，一天内不同时间下重复实验6次并进样检测，在6 天内由3名实验人员重复实验6次并进行检测，以检测浓度的RSD分别表示仪器精密度（Intra-sample）、日内方法精密度（Intra-day）和日间方法精密度（Inter-day）。如表3 所示，仪器RSD 为0.040%～2.0%，日内方法RSD为0.32%～3.0%，日间方法RSD为1.3%～3.6%，表明该方法具有良好的重现性。

2.5 实际样品检测

为验证本方法的可靠性，参照“1.5”方法提取和检测2份含有合成大麻素的巧克力检材，分别检出ADB-BUTINACA 和MDMB-FUBICA 成分，含量分别为0.51%和0.49%。

3 结 论

本文基于QuEChERS/高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱，建立了巧克力中18种合成大麻素的检测方法。本方法有效降低了基质效应，使18种合成大麻素在11 min内实现了分离检测，其中两对同分异构体（5F-EMB-PICA 和5F-MDMB-PICA；5F-EMB-PINACA 和5F-ADB）实现了分辨。所建立的方法具有良好的灵敏度和稳定性，能够满足巧克力中合成大麻素的定性和定量分析需要，为巧克力产品的安全监管及风险防范奠定了技术基础。