邻苯二甲酸二乙酯对活性污泥脱氮除磷性能的影响*

幸华秀 孔秀琴 罗英海 李 影 赵 霞

(兰州理工大学石油化工学院,甘肃 兰州 730050)

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类有毒的合成有机物[1]。PAEs作为增塑剂广泛应用于塑料、玩具、医疗器械等的生产过程中[2-3]。在合成材料中,PAEs以非共价键形式存在,易断裂重组渗入到环境中[4],PAEs在土壤、河流、空气、底泥和废水等多种介质中被频繁检出[5]。工业废水中含有高浓度PAEs,其中制药废水里PAEs质量浓度可达10 mg/L[6]。

作为一种典型的PAEs,邻苯二甲酸二乙酯(DEP)使用率较高,风化作用下易从塑料释放到环境中。周益奇等[7]发现,北京市污水处理厂进水中DEP质量浓度高达21.00 μg/L。污水处理厂大多采用活性污泥工艺,生物降解已成为废水中DEP去除的主要途径。目前,有关微生物对PAEs生物降解的研究较多,但关于PAEs对废水处理影响的研究有限。据报道,序批式活性污泥反应器(SBR)内氨氮去除率随着PAEs质量浓度(10～150 mg/L)的升高而降低,种群丰富度则先降低后升高最后逐渐趋于稳定[8]。高浓度邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)在垃圾渗滤液处理中对污染物去除和微生物群落有明显影响[9]。DEP具有一定生物毒性,可能会对活性污泥中的微生物产生不利影响,由此对活性污泥脱氮除磷性能带来干扰。目前,关于DEP对污泥微生物在废水处理中的影响还未得到深入探究。

本研究以模拟废水为进水,探究不同浓度梯度DEP对废水生物处理中脱氮除磷性能的影响,分析DEP作用下活性污泥生物量、胞外聚合物(EPS)和相关酶活性的变化,通过高通量测序统计相关脱氮除磷功能菌的相对丰度,揭示DEP对活性污泥脱氮除磷性能的影响机理。

1 材料与方法

1.1 试验装置

试验装置采用SBR反应器,反应器为圆柱形,内径28 cm、高度40 cm,反应器上端进水,右侧孔口出水。反应器顶部放置电动搅拌器。反应器采用空气压缩机曝气充氧,转子流量计控制空气流速,反应器内放置面包石作为微孔空气扩散器(见图1)。

1—空气压缩机;2—转子流量计;3—进水箱;4—面包石;5—出水口;6—电动搅拌器图1 试验装置Fig.1 Experimental setup

为减少进水水质波动,试验进水采用人工合成模拟废水,以自来水为溶剂,用C6H12O6、NH4Cl、KH2PO4调节进水COD、氨氮、总氮(TN)和总磷(TP)分别为274.45～617.50、35.84～39.06、38.35～41.79、1.81～1.97 mg/L。接种污泥取自某污水处理厂好氧曝气池,污泥混合液悬浮固体(MLSS)质量浓度为(4 330±10) mg/L。

1.2 试验方法

SBR工作体积为15 L,每周期运行时间12.0 h,包括进水0.3 h,厌氧2.0 h,好氧曝气4.0 h,缺氧搅拌4.0 h,静置1.0 h,排水0.3 h,闲置0.4 h。缺氧和厌氧采用机械搅拌进行混合,好氧阶段溶解氧(DO)为2.2～2.6 mg/L。试验分为6个反应阶段,第1阶段未添加DEP(CK处理),第2～6阶段DEP质量浓度分别为25、50、75、100、150 mg/L,每个阶段均运行7 d。

1.3 样品采集与分析

每天测定进出水中COD、氨氮、TN和TP含量,待各试验阶段运行稳定后,在典型周期的反应时段(厌氧、好氧、缺氧)内每隔1 h采集1次水样,测定COD、氨氮、硝态氮、亚硝态氮和TP浓度变化。采用5B-3C(V8)型多参数水质分析仪测定COD、氨氮、硝态氮、亚硝态氮和TP含量,采用碱性过硫酸钾消化—紫外分光光度法测定TN含量。

取各试验阶段末的污泥样品,每组取3个平行样,测定反应器内活性污泥的MLSS和挥发性悬浮固体(MLVSS);分析污泥中脱氢酶、硝酸盐还原酶(Nar)和亚硝酸盐还原酶(Nir)活性,具体方法参考文献[10]、[11];采用离心和超声波法分层提取污泥中的EPS,采用考马斯亮蓝法、蒽酮法测定EPS中蛋白质(PN)和多糖(PS)含量。

将污泥样品在Illumina MiSeq高通量测序平台上进行测序,用16S rDNA V3～V4区通用引物对(341F正向引物(CCTACGGGNGGCWGCAG)和806R反向引物(GGACTACHVGGGGTWTCTAAT))进行聚合酶链式反应扩增(PCR)。通过Usearch软件将有效序列分成具有97%同源性阈值的可操作分类单元进行统计分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析,采用Origin 8.0进行绘图。

2 结果和讨论

2.1 DEP对SBR性能的影响

2.1.1 DEP对COD及氮磷去除率的影响

测定各试验阶段每天进出水中COD、氨氮、TN和TP浓度,计算去除率,结果见图2。DEP为25 mg/L时,COD去除率为91.74%,与CK处理的COD去除率(92.92%)相比差异较小,此时微生物可利用DEP作为碳源。DEP为50 mg/L时,微生物对DEP敏感,COD去除率下降。随着DEP浓度的增加,微生物逐渐适应,SBR的COD去除率稳定在80%以上。AHMADI等[12]研究发现,DEP为300 mg/L的活性污泥系统运行12 h后COD去除率仍可达57%,这些结果均表明DEP达到一定浓度后会对碳源微生物产生毒性作用,但影响轻微,差异相对较小。

图2 DEP对水质指标去除率的影响Fig.2 Effects of DEP on the removal rate of water quality index

脱氮过程需要足够的碳源将氨氮转化为硝态氮、亚硝态氮、N2O或N2[13]。DEP为25 mg/L时,氨氮去除率为93.18%,较CK处理的氨氮去除率(91.68%)略有升高,但差异不显著(p>0.05)。随着DEP增加到75～150 mg/L,氨氮去除率显著下降(p<0.01),表明过量DEP会影响硝化菌的生长,抑制硝化过程,不利于氨氮的去除。TN去除率与氨氮去除率的变化趋势一致,DEP为25 mg/L时TN去除率(61.56%)较CK处理的TN去除率(53.01%)显著升高(p<0.01),但DEP增加到75～150 mg/L,TN去除率较CK处理显著下降(p<0.05),这与QI等[14]的研究结论相似,即低浓度DEP可作为一种潜在补充碳源提高TN去除率,但高浓度DEP会对TN和氨氮的去除有一定阻碍作用。

DEP为25～75 mg/L时TP去除率虽有所下降,但与CK处理相比差异不显著(p>0.05)。DEP达到100、150 mg/L时,TP去除率比CK处理分别降低9.32、24.92百分点,说明高浓度DEP会抑制聚磷菌(PAOs)活性,使TP去除率显著降低(p<0.05)。

2.1.2 DEP对COD及氮磷去除过程的影响

为进一步探究DEP对有机物以及氮磷去除过程的影响,研究SBR系统在各试验阶段典型周期内COD和氮磷浓度的变化,结果见图3。

图3 DEP对COD及氮磷生物去除过程的影响Fig.3 Effects of DEP on biological removal process of COD,nitrogen and phosphorus

由图3(a)可见,6个试验阶段的COD均在反应1 h内迅速下降,在4 h后COD保持在低水平,这是因为在有氧和搅拌条件下微生物能快速降解有机物[15]。活性污泥有一定的DEP降解能力,但降解时间较长,因此导致DEP为150 mg/L时,反应过程中COD浓度下降较慢[16],残余未降解的DEP使反应结束时COD浓度仍偏高。总体而言,DEP的添加对SBR中COD的去除影响相对轻微。

由图3(b)可见,当进水DEP≤50 mg/L时,反应结束时氨氮可降至10 mg/L以下,当进水DEP为75～150 mg/L时,氨氮在反应最初1 h迅速下降,到反应结束仍在20 mg/L左右,说明低浓度DEP对于氨氮去除的影响较低,而高浓度DEP能够明显抑制氨氮的去除。由图3(c)、图3(d)可见,反应过程中亚硝态氮和硝态氮的生成量总体随DEP浓度增加而减少,推断DEP主要影响脱氮过程中的硝化作用,即氨氮氧化至亚硝态氮和硝态氮的过程受到抑制,导致高浓度DEP下,反应结束时出水氨氮较高,亚硝态氮和硝态氮较低。

由图3(e)可见,在PAOs参与下,各试验阶段反应过程中均出现了释磷和吸磷现象,进水TP为1.87～1.94 mg/L,反应结束时TP为0.76～1.10 mg/L。反应初始2 h为厌氧阶段,PAOs释放磷酸盐,TP浓度增加[17]。CK处理反应2 h后SBR内TP达到3.60 mg/L;DEP为25、50、75、100、150 mg/L时,反应2 h后SBR内TP分别为4.31、4.75、4.94、4.82、5.09 mg/L,说明DEP对磷的释放过程有轻微促进作用,导致水体中TP含量升高;2～6 h为好氧阶段,PAOs从水体中吸磷,TP快速下降[18];DEP为25、50、75、100、150 mg/L时,反应结束出水TP分别为0.79、0.83、0.84、0.81、1.10 mg/L,均高于CK处理的0.76 mg/L。释磷阶段释放出的TP浓度越高,则吸磷阶段最终残留的TP浓度就越高,这是导致TP去除率随DEP浓度升高而下降的原因。可见,DEP通过影响释磷过程来抑制TP的去除。

碳源是生物脱氮除磷过程中的重要因素,影响系统中微生物代谢活性和氮磷去除效率[19]。DEP是一种碳源有机物,但对某些微生物而言是难降解的有毒物质,因此DEP会影响系统的脱氮除磷性能。

2.2 SBR中EPS的变化

有毒外源物质进入废水生物处理系统后,污泥生物量会发生变化,同时微生物会分泌EPS作为防御有毒环境的屏障[20]。在未添加DEP的CK处理阶段,SBR内MLSS稳定在4 330 mg/L,活性污泥状态良好。当DEP由25 mg/L提高到150 mg/L时,SBR内MLSS和MLVSS出现波动,说明DEP对污泥中微生物的生物量有一定影响。MLSS、MLVSS在DEP加入后均逐渐下降,在DEP为75 mg/L时出现最低值3 066、2 448 mg/L。DEP为150 mg/L时,SBR内MLSS、MLVSS虽低于CK处理,但仍分别达到3 695、3 093 mg/L,表明DEP的生物毒性对生物量有一定的冲击,但随着长时间的驯化,微生物能逐渐适应进水中的DEP。

EPS主要由PN和PS组成[21]。从图4可以看出,EPS中PN和PS含量随DEP的添加有不同程度的增大,且PS的增加幅度大于PN。PN和PS的增加可减轻DEP对微生物的胁迫[22]。与CK处理相比,DEP为150 mg/L 时PS增加了1.88倍,PN增加了0.73倍,表明DEP的存在主要促进了PS的形成,使EPS的总量提高。

图4 DEP对PS与PN的影响 Fig.4 The effect of DEP on PS and PN

2.3 底物酶活性的变化

酶活性在一定程度上可反映系统受污染胁迫情况,评估系统运行状态。脱氢酶活性表征污染物对微生物的影响[23],不同DEP含量下,脱氢酶活性变化见图5。与CK处理相比,除DEP为25 mg/L时脱氢酶活性略有下降,其余DEP含量下脱氢酶活性均显著提高(p<0.01),其中DEP为75、100、150 mg/L时脱氢酶活性分别提高了77.37%、112.86%、106.53%,这说明微生物在DEP毒性胁迫下做出了应激表达,可通过分泌脱氢酶来中和毒素[24]。推测加入DEP初期,SBR内微生物受到DEP的冲击,脱氢酶活性下降,之后微生物在DEP胁迫下做出相应调整,群落里形成能降解DEP的菌群,导致脱氢酶活性升高。KAPANEN等[25]在添加PAEs的土壤中也检测到脱氢酶活性增强。可见,在适宜范围(25～150 mg/L)内,DEP刺激了脱氢酶活性,微生物能够将DEP作为碳和能源物质进行降解利用。

图5 DEP对SBR系统内活性污泥3种酶活性的影响Fig.5 Effects of DEP on three enzyme activities of activated sludge in SBR system

Nar可以参与硝态氮向亚硝态氮的转化,试验进水不含硝态氮、亚硝态氮,硝态氮、亚硝态氮均由氨氮转化生成。由图5可见,DEP为0～150 mg/L时,Nar活性随着DEP浓度的增加波动较大,DEP为100 mg/L时达到最大值0.68 mg/(mL·d),DEP为25 mg/L时达到最小值0.16 mg/(mL·d)。Nar对DEP的冲击较敏感,在DEP为25 mg/L时活性暂时下降,经过一段时间的适应,随着DEP浓度调高,Nar活性逐渐恢复,甚至超过CK处理的Nar活性,这可能是微生物逐渐适应污染物并利用其作为碳和能源的结果。有研究指出,当外来污染物进入活性污泥系统后,用于降解污染物的相关酶(胞外酶等)会与污染物结合,降低污染物对微生物的胁迫水平[26]。DEP在50～150 mg/L时微生物分泌更多的Nar,可见DEP对Nar活性总体影响不大,但因DEP对硝化过程的抑制,使得DEP较高(75～100 mg/L)时硝态氮生成量较少(见图3(d)),因此尽管具有较高的Nar活性,但受Nar作用基质的限制,最终对TN去除率没有较大贡献。

Nir可在缺氧条件下将亚硝态氮还原为NO,是反硝化的关键酶[27]。由图5可见,Nir活性随DEP浓度的增加而下降,DEP为25、50、75、100 mg/L时Nir活性变化并不明显,当DEP为150 mg/L时,Nir活性达到显著抑制水平(p<0.05),抑制率为39.02%,表明高浓度DEP会抑制亚硝酸盐还原微生物的活性。另外,酶通常由底物诱导合成,底物浓度是影响酶活性的一个重要因素,底物浓度过低会抑制酶活性[28]。高浓度DEP抑制硝化过程使得亚硝态氮浓度过低,从而导致Nir活性降低。

2.4 微生物群落结构

由于DEP有较强的生物抑制性,因此推测DEP可能会改变污泥中微生物群落结构,影响常规污染物的去除效果。

2.4.1 优势微生物群落组成

不同DEP处理下活性污泥优势菌属丰度变化见图6。不动杆菌属、假单胞菌属、Phaeodactylibacter和金黄杆菌属的相对丰度处于相对较高水平。假单胞菌属是一种脱氮除磷菌[29],高浓度DEP的生物毒性导致其相对丰度降低,DEP由0 mg/L增至150 mg/L时,假单胞菌属相对丰度由18.86%降至1.21%,这可能是TN、TP去除率下降的主要原因。不动杆菌属主要参与苯酚类物质的降解[30]。添加DEP后,不动杆菌属的相对丰度远高于CK处理的1.44%,说明DEP胁迫下污泥中出现了DEP降解菌。在DEP为50～150 mg/L时,活性污泥中还发现了一些相对丰度较高的菌群,Phaeodactylibacter、动胶菌属、金黄杆菌属和小梨形菌属逐渐成为优势菌,可能是这些优势细菌对DEP及其代谢物的抗性诱导了其增殖。

图6 活性污泥在属水平的细菌群落组成 Fig.6 The bacterial community composition of activated sludge at the genus level

2.4.2 DEP对脱氮除磷功能菌的影响

当DEP为150 mg/L时,DEP影响了出水水质和微生物群落结构,导致系统性能恶化。为深入了解DEP对系统脱氮除磷的影响,对CK处理与DEP为150 mg/L的泥样脱氮除磷功能菌进行对比分析。

试验中检测到2种亚硝酸盐氧化菌(NOB),分别为硝化螺旋菌属(Nitrospira)[31]和芽孢杆菌属(Bacillus)[32];3种反硝化菌(DNB),分别为假单胞菌属[33]、不动杆菌属[34]和独岛杆菌属[35]。假单胞菌属[36]、不动杆菌属[37]均可参与氮磷循环,既是DNB也是典型的PAOs。此外,狭义梭菌属[38]也一种典型的PAOs。Candidatus_Competibacter[39]属于聚糖菌(GAOs)。

由图7可见,DEP为150 mg/L时泥样中硝化螺旋菌属和芽孢杆菌属相对丰度分别为0.01%、0.04%,低于CK处理的0.87%、0.74%,表明高浓度DEP抑制了硝化螺旋菌属和芽孢杆菌属的活性,NOB几乎被消除,硝化过程被抑制。DNB参与了硝态氮和亚硝态氮的还原过程,当DEP为150 mg/L时,假单胞菌属、不动杆菌属和独岛杆菌属3种DNB的总相对丰度(16.41%)明显低于CK处理(25.14%),与图5中Nar和Nir活性下降相对应。可见,DEP减少了脱氮功能菌群的相对丰度,对SBR系统的脱氮性能产生不利影响。

图7 属水平上脱氮除磷功能微生物的相对丰度Fig.7 Relative abundance of functional microorganisms for nitrogen and phosphorus removal at the genus level

总体看来,在DEP胁迫下PAOs相对丰度下降,GAOs略有上升,GAOs与PAOs竞争碳源,会间接影响磷的去除,此结果与TP去除情况变化一致,添加DEP后系统生物除磷性能受到抑制。

3 结 论

(1) DEP对活性污泥的脱氮除磷性能产生不利影响。与未添加DEP的CK处理相比,DEP为75～150 mg/L时,TN和氨氮去除率显著下降;DEP为100、150 mg/L时,TP去除率受到显著抑制;DEP对COD的去除无显著影响。

(2) 在DEP暴露下,活性污泥中微生物的生物量减少,EPS增加。DEP在50～150 mg/L时脱氢酶被激活,从而保证COD去除率稳定在80%以上,在此浓度水平下,Nar活性也有所提高,25～100 mg/L的DEP对Nir活性无显著影响,但DEP为150 mg/L时Nir活性显著降低。

(3) 在150 mg/L DEP胁迫下,假单胞菌属相对丰度明显降低,不动杆菌属、Phaeodactylibacter、动胶菌属、金黄杆菌属和小梨形菌属成为优势菌属。此外,NOB、DNB和PAOs的相对丰度下降,导致系统脱氮除磷性能受到抑制。