甘蔗霉变病原菌梨孢假壳及其毒素的研究进展

梁雪莲 廖洁 蒋文艳 陈伟 王海军 莫磊兴 肖燕艳妮 王天顺

摘 要：甘蔗在运输和贮存期间极易受病原菌侵染，发生变质并产生毒素，其中甘蔗受梨孢假壳感染及产生3-硝基丙酸（3-NPA）毒素是引起食用变质甘蔗中毒的主要原因。文章通过综述甘蔗霉变病原菌梨孢假壳的鉴定、产毒条件、环境影响因素及其3-NPA毒素合成机理、检测方法等研究进展，发现目前尚缺乏对甘蔗霉变病原菌梨孢假壳的全面、系统认识，也未对其产毒能力、产毒机理及毒性快速监测方法等提出明确要求和出台相关规定，关于甘蔗采后霉变的防控技术也鲜见报道。因此，今后应在以下几方面开展相关研究：（1）系统开展甘蔗梨孢假壳产毒能力评价、菌株分类及快速鉴定方法等研究，对高毒菌株所属区域的甘蔗消费市场进行重点监控，为疑似感染高毒菌株的甘蔗预警提供科学依据和技术支撑；（2）在侵染甘蔗条件下，深入研究环境因素对梨孢假壳毒素3-NPA产生和积累规律的影响；（3）探究毒素合成途径及分子调控机理，阐明梨孢假壳毒素3-NPA的代谢过程，解析生物合成3-NPA的系统理论知识；（4）利用分子生物学手段开展3-NPA检测研究，提高检测方法的准确性、灵敏度等；（5）通过生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假壳感染及其毒素3-NPA的合成，研制筛选出高效、安全、适用的甘蔗防霉变药剂。

关键词：甘蔗；霉变；梨孢假壳（节菱孢）；3-硝基丙酸（3-NPA）

中图分类号：S566.1                              文献标识码：A  文章编号：2095-820X（2023）02-0028-04

0 引言

鲜食甘蔗具有丰富的营养，且富含葡萄糖、蔗糖和果糖等易吸收的糖类（含糖量约12%），以及人体必需的多种维生素、氨基酸和微量元素，尤其是铁含量高达9 mg/kg，因此又被称为补血果［1］。中医认为甘蔗入肺、胃二经，具有润燥、补肺益胃、清热、生津、下气等功效。甘蔗因其口感甜蜜、营养丰富，且具有补益身体之功效，而深受消费者喜爱［2］。目前，我国甘蔗种植区域已由过去的江南8省（区）扩延到22省（市、区）（不包括台、港、澳），全国蔗地总面积约27.0万ha，年总产量超过2000万t，产值超过200亿元人民币。我国的甘蔗种植主要集中在广西、广东、福建、云南、海南、四川、江西等南方地区，仅广西甘蔗种植面积就超过2.7万ha，约占全国种植面积的10%，居全国首位。每年元旦前后至春节前后为甘蔗的集中采收季节，大量甘蔗运往我国北方地区的消费市场，但甘蔗在运输和贮存期间极易受病原菌侵染，发生变质，并产生微生物毒素。自1972年我国首次发生变质甘蔗引起中毒病例以来［3］，几乎每年都有因食用变质甘蔗而引起中毒的病例发生。为此，文章通过综述甘蔗霉变病原菌梨孢假壳的鉴定、产毒条件、环境影响因素及其毒素3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NPA）合成机理、检测方法等研究进展，以期为甘蔗生产、储运保鲜、食用安全预防及相关科学研究提供参考。

1 甘蔗霉变病原菌梨孢假壳（节菱孢）

1.1 梨孢假壳（节菱孢）鉴定研究进展

节菱孢（Arthrinium）在自然界广泛分布，常寄生或腐生于长有植被的土壤和一些经济作物的根部、茎部及叶片上［4］。节菱孢系Kunze于1817年命名［5］，根据菌株的生长特性、分生孢子形态，将其归类于半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）暗色孢科（Sematiaceae）［6］。刘兴玠等［7］从中毒甘蔗和变质甘蔗样品中分离获得产毒的节菱孢，根据菌落形态特征、生长速度、分生孢子着生状态、孢子形态等形态学进行分类鉴定，最终分为甘蔗节菱孢（A. sacchari M. B. Ellis）、蔗生节菱孢（A. saccharicolz Stevenson）和暗孢节菱孢［A. phacospermum （Corda） M. B. Ellis］。Pintos和Alvardo［8］将从变质甘蔗中分离获得的甘蔗节菱孢、蔗生节菱孢、暗孢节菱孢等55种节菱孢重新划分为梨孢假壳属（Apiospora）。广西农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所農产品质量安全风险评估课题组从霉变甘蔗中分离出能产生3-NPA的另一种梨孢假壳，经形态及内转录间隔区（ITS）标记技术鉴定，确定为芦竹梨孢假壳（A. arundinis）［9］。这是首次采用分子鉴定梨孢假壳，且对筛选出来的芦竹梨孢假壳进行产毒能力鉴定，结果发现不同菌株间存在明显差异。

刘兴玠等［10］从引起中毒重症的甘蔗中分离获得的优势菌均为节菱孢，其占比为58.7%～65.6%，而中毒甘蔗样品中的节菱孢检出率达32.0%。甄应中等［11］从变质甘蔗中分离获得的串珠镰刀菌均不产毒，而产毒的节菱孢比例高达48.8%。胡文娟等［12］证实节菱孢产生的毒素为耐热的3-NPA，主要损害神经中枢，对人类及动物均有强烈的毒性作用。侯正宗等［13］对中毒死亡患者食用剩下的同节甘蔗及同批库存、市售甘蔗进行真菌分离，结果显示节菱孢的检出率分别为70.0%、57.1%和43.5%。刘兴玠等［14］通过采集自然环境中的树皮、秸秆、草类及土壤等样品进行分析，结果发现只在长期贮存过甘蔗的仓库土壤中分离出节菱孢，说明节菱孢极少腐生于一般土壤及其他植物；此外，测定发现米曲霉（Aspergillus oryzae）、黄曲霉（A. flavus）和酱油曲霉（A. sojae）等57株霉菌均不产生3-NPA，故推测节菱孢是变质甘蔗中毒的唯一病原菌。已有研究证实，误食含高浓度3-NPA的变质甘蔗可导致严重的食物中毒，临床上一般在食用变质甘蔗后2～5 h出现中毒症状，轻者伴有恶心、呕吐、腹痛、泻肚等消化道症状，部分患者出现晕厥、视物不清晰、不能站立；重症者则手脚颤抖，阵发性强直抽搐，甚至出现昏迷［15］。

1.2 环境因素对梨孢假壳（节菱孢）的影响

刘江等［16］分别从菌株、培养基、pH、培养温度、培养时间等方面探讨环境因素对节菱孢产毒的影响，结果表明影响节菱孢产毒的因素排序为菌株>温度>时间>培养基>pH；其中，以麦芽汁—酵母膏为培养基、20 ℃下培养21 d、pH 4.5时的3-NPA产量最高，是节菱孢在实验条件下的最佳产毒因子。目前，尚缺乏在侵染甘蔗条件下環境因素对梨孢假壳毒素产生和积累规律等方面的相关研究。刘江等［16］对甘蔗霉变过程中各环节进行调查研究，发现影响甘蔗霉变的关键因素是贮存条件和贮存时间，因此今后应重点关注对影响节菱孢繁殖及产毒因素的研究，为预防食用甘蔗中毒提供参考依据 。刘兴玠等［14］研究证实，节菱孢在适宜的基质中、15～28 ℃下能产生大量的3-NPA毒素，且毒素含量随贮存时间的延长而增加。可见，贮存期控制甘蔗霉变是预防果蔗中毒的关键所在，但目前关于甘蔗采霉变防控技术及防霉变杀菌药剂的研究鲜见报道。

2 3-NPA毒素的研究进展

2.1 3-NPA合成机理研究

3-NPA为结构简单的小分子生物毒素，其不仅来源于霉变甘蔗，一些真菌和高等植物也具有合成3-NPA毒素的能力。目前，已知能合成3-NPA的真菌有黄曲霉、米曲霉、深酒色青霉（Penicillium atrovenetum）、链丝菌（Streptomyces sp.）、节菱孢、放线菌（Actinomycete）和丝状菌（Filamentousfungus）等；此外，金虎尾科（Malpighiaceae）、堇菜科（Violaceae）、豆科（Leguminosae）等高等植物同样具有合成3-NPA毒素的能力［17］。产毒素真菌只能合成游离态的3-NPA毒素，无法合成3-NPA的葡萄糖酯类衍生物，而高等植物能合成3-NPA的葡萄糖酯类衍生物［17］。能合成3-NPA毒素的真菌大部分能使3-NPA毒素降解成硝酸盐或亚硝酸盐，故推测3-NPA毒素可能是天门冬氨酸降解生成硝酸盐途径的一个关键中间物质：天门冬氨酸→β-氨基丙酸→3-NPA→亚硝酸盐→硝酸盐［17］。Birch等［18］、Birkingshaw和Dryland［19］采用同位素14C标记研究深酒色青霉的3-NPA毒素合成机理，结果发现β-氨基丙酸并不参与3-NPA的合成，是由天门冬氨酸通过氨基氧化及失去C1而形成。Shaw［20］研究表明，深酒色青霉粗提液可催化β-硝基丙烯酸还原成3-NPA，催化这一反应的酶即为β-硝基丙烯酸还原酶。但至今关于梨孢假壳产毒能力稳定性及3-NPA毒素的合成、降解途径和分子调控机理尚无文献报道。

2.2 3-NPA检测方法

甘蔗3-NPA毒素含量检测对其食用安全保障具有重要的现实意义。早期检测3-NPA毒素主要采用薄层色谱法［21，22］，国家标准检测法BJS 202205《甘蔗及甘蔗汁中3-NPA的测定》规定采用高效液相色谱检测3-NPA［23］，且要求样品的检出限和定量限分别为0.3和1.0 mg/kg。随着仪器设备的发展革新，汪儆等［24］利用气质色谱—质谱法对豆科中的3-NPA毒素进行定性和定量检测；刘勇等［25］利用热能检定器—气相色谱对大鼠血清中的3-NPA毒素含量进行检测，其灵敏度可达4 ng/mL；邵国健等［26，27］利用固相萃取—离子色谱法、免试剂离子色谱法检测甘蔗中的3-NPA毒素，发现在0.1～50.0 μg/mL范围内线性关系良好，加标回收率为89.2%～102.0%，检出限为0.03 mg/kg；解娜等［28］采用二极管阵列与毛细管电泳结合检测甘蔗中的3-NPA毒素，发现在1.0～100.0 mg/L范围内线性关系良好，加标回收率为95.2%～103.9%，检出限为0.3 mg/L。Jiang等 ［29］采用乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器检测3-NPA，其抑制率和3-NPA含量的对数在0.10～30.00 μg/L范围内线性关系良好，方法稳定、灵敏，检测限为0.05 μg/L，甘蔗样品中3-NPA加标回收率达88.8%～98.2%，其灵敏度远高于国家标准检测法BJS 202205。目前，3-NPA毒素检测最常用的方法是液相色谱法和液相色谱—质谱联用，其准确度和灵敏度均较高，但也存在成本高、专业要求高、耗时长等弊端；荧光法和电化学法在成本、检测速度等上具有优势，但其灵敏度、选择性等需进一步优化。

3 展望

尽管国内外已开展了大量关于甘蔗霉变病原菌梨孢假壳及其毒素的研究工作，但主要集中在梨孢假壳及3-NPA毒素的分离鉴定方面，尚缺乏对甘蔗霉变病原菌梨孢假壳的全面、系统认识，也未对甘蔗霉变病原菌的产毒能力、产毒机理及毒性快速监测方法等提出明确要求和出台相关规定，关于甘蔗采后霉变的防控技术也鲜见报道，以至于难以对甘蔗采后储运过程的食用安全性进行全面系统地风险评估，更无法针对性提出有效的甘蔗霉变病原菌防控措施。因此，今后应在以下几方面开展相关研究：（1）系统开展甘蔗梨孢假壳产毒能力评价、菌株分类及快速鉴定方法等研究，对高毒菌株所属区域的甘蔗消费市场进行重点监控，为疑似感染高毒菌株的甘蔗预警提供科学依据和技术支撑；（2）在侵染甘蔗条件下，深入研究环境因素对梨孢假壳毒素3-NPA产生和积累规律的影响；（3）探究毒素合成途径及分子调控机理，阐明梨孢假壳毒素3-NPA的代谢过程，解析生物合成3-NPA的系统理论知识；（4）利用分子生物学手段开展3-NPA检测研究，提高检测方法的准确性、灵敏度等；（5）通过生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假壳感染及其毒素3-NPA的合成，研制筛选出高效、安全、适用的甘蔗防霉变药剂。

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