颗粒活性炭固定化菌修复石油污染地下水

孙 娟，魏鹏硕，郑 瑾，王 宁，宋权威，汪肖洋，李 冉，王子豪，赵朝成，刘 芳，张秀霞

(1.中国石油大学(华东) 化学化工学院，山东 青岛 266580；2.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206；3.中国石油集团安全环保技术研究院有限公司，北京 102206)

石油在推动全球工业化进程的同时由于泄漏可导致土壤环境被污染，并在降雨等因素作用下透过包气带污染地下水环境，目前已成为地下水中最常见的有机污染物之一[1-4]。据统计，中国现有加油站区地下水已受到不同程度的(占比50%～85%)石油污染[5]，炼油企业附近地下水受到石油污染，可能威胁饮用水安全[6]。因此，必须对污染地下水的石油进行及时、有效的清除。

目前，常用的石油污染土壤地下水的修复方法有地下水曝气、化学氧化、微生物修复等[1]。其中，微生物修复具有产物无毒无害、经济合理等优势，已成为石油污染土壤修复的有效手段[7-10]。土壤中存在能够降解石油的土著菌，如枯草芽孢杆菌和假单胞菌等[11-12]。但是，地下水环境与土壤差异明显，地下水流动极易导致游离菌流失，从而影响微生物的修复效果[13]。而固定化微生物技术通过将微生物负载于固定化载体上，可以使微生物保持一定的密度和活性[14]，比游离菌具有更高的环境耐受性[15-19]，成为地下水生物修复研究的热点。微生物固定化载体有聚氨酯泡沫、聚乙烯醇、海藻酸钠和活性炭[20]等。固定化方法主要有吸附法、包埋法和共价交联法等[21]。其中，共价交联法一定程度上会抑制微生物活性，聚合物包埋法制备成本较高且力学稳定性差异较大，限制其应用[22]。利用活性炭等多孔载体吸附固定化，结合力会相对较弱，但其成本低，如活性炭价格仅为8～10元/kg，远低于海藻酸钠、壳聚糖等固定化包埋剂的价格；易操作且载体机械强度高，孔道结构利于氧气、代谢物扩散，对微生物无毒性[23]，是实际应用最广泛的固定化方法之一。但目前仍缺少活性炭固定化微生物修复石油污染地下水的系统研究，因此笔者选用前期研究筛选的具有良好吸附性能的椰壳活性炭作为微生物固定化载体[24-28]，并对其修复效能、作用条件和作用机理进行探讨，为该颗粒活性炭固定化菌直接投加用于低温地下水环境中的石油污染物高效去除提供理论依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验油样品

实验油样品采用市售0#柴油和委内瑞拉原油；实验用地下水采集自炼油厂附近未受污染的天然地下水；模拟油污水样品是通过将一定质量的原油/柴油直接加入装有100 mL灭菌地下水的锥形瓶中进行配置并封口保存；油污土壤取自东营某炼油厂0～50 cm层土壤样品，去除植物根系和石块后经2 mm尼龙筛过筛备用。活性炭为市售椰壳活性炭(40～60目)，用去离子水冲洗6～8次，洗去炭黑等杂质后于105 ℃烘干后装瓶备用。实验用油样品及地下水理化性质分别见表1、表2。

表1 实验油样品的性质

表2 实验用地下水主要性质

1.1.2 培养基

(1)牛肉膏蛋白胨液体培养基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH值 7.0；

(2)牛肉膏蛋白胨固体培养基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，琼脂15 g/L，pH值7.0；

(3)原油驯化培养基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，原油10、15、20 g/L，pH值 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 石油降解菌的筛选、鉴定和复配

取5 g油污土于灭菌蒸馏水中，在30 ℃、转速160 r/min下振荡6 h，静置30 min，取上清液加入液体培养基中，于30 ℃、转速160 r/min下富集24 h。每次加2 mL富集液分别至3个浓度梯度的原油驯化培养基中，每梯度在30 ℃、转速160 r/min条件下培养7 d。取2 mL已完成驯化的微生物培养液加入到新鲜液体培养基中培养24 h，稀释涂平板，分离纯化多次至得到单个纯菌落。经16SrDNA种属鉴定，6株单菌分别为铜绿假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa)HL、克罗诺杆菌属(Cronobacter)ZH、炭疽芽孢杆菌属(Bacillusanthracis)DF、沙门氏菌属(Salmonellasp.)L4、肺炎克雷伯菌属(Klebsiellapneumoniae)D1和N3。对富集菌液用稀释涂布法计数，绘制菌悬液在600 nm处的光密度(OD600)对应的微生物数量的标准曲线。以降油性能最佳的HL菌与其它单菌复配各菌群P，复配菌群各单菌添加量如表3所示。

表3 复配菌群各单菌添加量

1.2.2 固定化菌的制备及活性炭固定菌量测定

取适量椰壳活性炭于100 mL液体培养基中，灭菌冷却后加入4 mL菌液于转速160 r/min、15 ℃恒温振荡箱中分别固定6、12、18、24、30、36 h，测定上清液OD600值，相同条件不加活性炭为空白样对照。固定化稳定后，于转速1000 r/min离心10 min，过滤舍去上清液，用生理盐水清洗3次，将离心所得沉淀真空冷冻干燥，即得固定化菌[9，29]；采用扫描电子显微镜观察活性炭固定化菌结构。按照式(1)计算单位质量活性炭固定菌量(Γ，cell/g)。

(1)

式中：m为活性炭质量，g；V为菌液体积，mL；c1、c2为固定前后的菌浓度，cell/mL。

1.2.3 地下水中石油去除率测定

将4 mL降油菌液或者一定质量的固定化菌加至用100 mg石油和100 mL地下水模拟的含油地下水中，于15 ℃、转速120 r/min的恒温振荡箱中反应7 d后，按照式(2)计算石油去除率(η，%)。

(2)

式中：ρ0、ρe分别表示加入菌液或固定化菌进行修复前、后地下水中的石油质量浓度，mg/L。

采用紫外分光光度计法测定地下水中石油质量浓度，原油和柴油的标准曲线方程分别如式(3)和(4)所示。

ρ01=0.0189x+0.0068

(3)

ρ02=0.0184x+0.0088

(4)

式中：ρ01为原油标准曲线中对应油质量浓度，mg/L；ρ02为柴油标准曲线中对应油质量浓度，mg/L；x为吸光度，abs。

前期实验测得所用柴油溶解度为40 mg/L，原油溶解度为10 mg/L，石油在水中被降解前多以浮油形态存在，采用石油醚多次萃取后测得萃取率可达80%，设置空白样对照，降低实验过程中转移、萃取损耗误差，计算石油去除率。采用单因素实验探究不同条件下固定化菌对地下水中石油的去除率。考察因素有：固定化菌投加量(0.5～3.0 g/L)，油质量浓度(500～3000 mg/L)，pH值(4～10)，温度(15、30 ℃)。

1.2.4 含油地下水表征分析

对含油地下水分别采用单一活性炭、游离菌和固定化菌修复7 d后，采用Zeta电势/动态光散射仪(Zetasizer Nano ZS型，英国马尔文仪器有限公司产品)和激光粒度仪(Zetasizer Nano ZS90型，英国马尔文仪器有限公司产品)分别测定地下水的Zeta电位及地下水中的油滴分散粒径[30]；采用气相色谱-质谱仪(7890A-5975C型，美国安捷伦科技有限公司产品)对含油地下水中不同石油烃类组分进行定性和定量分析[24]。

1.2.5 高通量测序

冷冻干燥后的固定化菌样品经1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA，为确保样本的微生物群落得到充分提取，对16SrDNA基因片段进行了扩增和测序，其中16S引物序列为27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。聚合酶链式(PCR)反应条件为：预变性，95 ℃，5 min；变性，95 ℃，30 s；退火，55 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min。重复变性到延伸流程进行35个循环，最终以72 ℃为修复延伸温度进行10 min，采用Illumina MiSeq平台对样品微生物群落DNA片段进行双端测序。最后使用QIIME软件，获取样品在各个分类水平上的群落结构组成[9，31]。

2 结果与讨论

2.1 微生物对地下水中石油的去除率

筛选出的6株单菌及其复配菌在15 ℃下通过生物降解对地下水中石油的去除率如图1所示。由图1(a)可以看出，铜绿假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa)HL菌株石油去除率最高，为18.56%，且由排油圈实验得出HL菌株发酵液分散油膜的能力最佳，表明其产表面活性剂能力更强，在降解石油的过程中发现其可将石油乳化为细小的油滴，可促进对石油的降解。其他菌株对石油的去除率为8.20%～11.97%。由图1(b)可以看出，PseudomonasaeruginosaHL菌和Salmonellasp.L4菌复配菌群P5(HL/L4体积比为1∶1)对地下水中石油的去除率最高，为21.33%。复配菌液由于微生物之间存在协同与拮抗作用导致生物降解率升高或降低[31]，一定油浓度下复配菌种太多会由于竞争造成生物降解率明显降低，如P10。

HL—Pseudomonas aeruginosa；N3—Klebsiella pneumoniae；ZH—Cronobacter；DF—Bacillus anthracis；D1—Klebsiella pneumoniae；L4—Salmonella sp.；P1—P10—Ten different compound flora

2.2 固定化菌的表征结果

游离菌经活性炭吸附固定不同时间后测定上清液OD600值，相同条件不加活性炭为空白样对照，以二者OD600差值(ΔOD600)随固定时间的变化表征固定菌量的变化趋势(见图2 (a))。活性炭吸附固定菌会导致上清液菌密度降低，OD600值减小，与空白样间OD600差值会增大，图中随着固定化时间在1～6 h增加，ΔOD600增大，说明活性炭固定化菌量快速增加，6～30 h时出现脱附现象，脱附平衡后固定菌量再次上升，第6 h和第36 h时的ΔOD600相近。因此，6 h时活性炭固定菌量已达最大值，但由于固定时间较短，作用力较弱，随即出现脱附现象，随着固定时间的延长，活性炭固定化微生物在36 h时达到较稳定状态并在12 h内基本不再发生脱附现象。因此将活性炭在15 ℃时固定化微生物的最佳时间确定为36 h。

图2 活性炭固定化菌上清液OD600差值(ΔOD600)随时间的变化及活性炭吸附前后SEM照片

椰壳活性炭具有蜂窝状排列的孔结构，且孔内部有规则褶皱，利于微生物附着(见图2(b))。在笔者之前的研究中已测得该椰壳活性炭O/C和(O+C)/C质量比要小于其他活性炭，炭化程度高，极性低，疏水性强[24]，固定微生物后确定活性炭褶皱表面分布有杆状菌(见图2(c))。虽然加入2种单菌的体积比为1∶1，但不能保证活性炭按此比例固定化菌体，因此对活性炭固定化菌进行高通量测序，分析活性炭固定化2种单菌的比例，假单胞菌(Pseudomonadaceae)占59.98%，而沙门氏菌(Salmonellasp.)占40.02%，固定化菌量约为1.18×1011cell/g。

2.3 固定化菌对地下水中石油的去除效果

2.3.1 固定化菌投加量对地下水中石油去除率的影响

固定化菌投加量对地下水中石油去除率的影响结果如图3所示。地下水中原油和柴油去除率均随固定化菌投加量增加而增大。当固定化菌投加量由0.5 g/L增大到1.0 g/L时，原油去除率由58.06%增加至83.63%，柴油去除率由52.15%增加至75.20%；继续增加菌投加量，地下水中2种油的去除率增速均变缓。这是因为在一定范围内，随着活性炭固定化菌投加量的增大，活性炭上的吸附位点和固定化的微生物量均增多，而且地下水体系供给微生物生长繁殖的营养充足，所以被吸附和降解的油量均增加；继续增加固定化菌投加量，微生物由于数量增加可能产生竞争和抑制，且水中油浓度已经降至较低，所以单位固定化菌对石油的吸附量和降解量均出现增长缓慢甚至下降趋势[24]，使整体去除率增长缓慢。因此，活性炭固定化菌最佳投加量为1.0 g/L。

图3 固定化菌投加量对石油去除率(η)的影响

2.3.2 油质量浓度对地下水中石油去除率的影响

固定化菌投加量为1.0 g/L时对地下水中原油和柴油的去除率随水中油质量浓度的变化如图4所示。由图4可以看出，随着油质量浓度的增加，活性炭固定化菌对2种油的去除率均出现先增大后减小的趋势。当油品质量浓度由500 mg/L增加至1000 mg/L时，原油去除率由74.78%增加到85.02%，柴油去除率由68.53%增至74.05%；随着油质量浓度继续升高，地下水中油去除率降低。这是因为一定量的活性炭固定化菌能提供的吸附位点和菌量一定，当地下水中油质量浓度不高时，油质量浓度的增加可以促进菌株生长，从而提高油的去除率[32]；但当地下水中油质量浓度过高时，油主要以浮油形态存在，在水中的分散度降低，浮于水面的固定化菌吸附位点不足，活性炭吸附作用变弱，且较高的油质量浓度对活性炭上的菌群存在一定的毒害作用[33]，抑制菌株生长繁殖，因此油的总体去除率降低。

图4 不同油质量浓度(ρ)条件下活性炭固定化菌对地下水中石油的去除率(η)

2.3.3 pH值对地下水中石油去除率的影响

在固定化菌投加量1.0 g/L、油质量浓度为1000 mg/L条件下，活性炭固定化菌对地下水中石油的去除率随地下水pH值的变化如图5所示。由图5可以看出：在pH值为7时，活性炭固定化菌对地下水中原油、柴油的去除率最高，分别为84.96%和74.53%；当pH值小于7时，固定化菌对地下水中石油的去除率与pH值呈正相关；当pH值大于7时，石油去除率随pH值的升高而降低。这是因为在中性条件下固定化菌活性最高，对地下水中石油去除率最高；而在高pH值下固定化菌表面存在大量负电荷，导致其与油滴之间的静电排斥作用增强，吸附量变低[9，34-35]。因此，活性炭固定化只能在一定程度上降低外部环境对微生物的不良影响，酸碱度相对过高时固定化菌对地下水中石油的去除率仍然会降低。

图5 不同地下水pH值条件下活性炭固定化菌的石油去除率(η)

2.3.4 温度对地下水中石油去除率的影响

在固定化菌投加量1.0 g/L、油质量浓度1000 mg/L、pH值为7条件下，活性炭固定化菌对地下水中2种油的去除率随温度的变化如表4所示，并与相同条件下含相同菌量的复配游离菌、相同质量的活性炭的去除效果进行比较。由表4可以看出，固定化菌对地下水中原油在温度为15、30 ℃时的去除率分别为85.02%和85.27%，对柴油去除率分别为74.53%和75.20%。这是因为随着温度由15 ℃升高到30 ℃，游离菌活性增强，通过微生物对地下水中油的生物降解导致原油、柴油的去除率分别增加14.09、13.83百分点；而升温降低了油的黏度引起活性炭吸附容量降低[35]，活性炭对地下水中油的吸附作用降低，造成原油、柴油的去除率分别降低9.66、12.43百分点；因此整体表现为固定化菌对地下水中原油、柴油的去除率仅分别增大0.25、0.67百分点。

表4 不同温度(T)条件下地下水中石油去除率(η)

温度为15 ℃时，游离复配菌通过生物降解对地下水中原油去除率为23.82%，活性炭通过吸附作用对原油去除率为70.26%，固定化菌对地下水中原油去除率为85.02%，固定化菌相比游离菌提高61.2百分点。可见，活性炭的吸附固定作用为固定化菌除油的关键环节。由于该椰壳活性炭对2种油的吸附均可在数小时达到平衡[24]，因此，活性炭固定化菌可通过快速吸附、缓慢降解最终去除地下水中的石油。

综上所述，活性炭固定化菌在不同温度下对2种油均具有很好的去除效果。

2.4 含油地下水表征分析结果

2.4.1 Zeta电位及油滴粒径

含油地下水中分别加入活性炭、游离复配菌及活性炭固定化菌的Zeta电位及分散油滴平均粒径如表5所示。由表5可以看出，含原油地下水加入固定化菌后Zeta电位由-31.17 mV降至-5.29 mV，绝对值降至最低，且其油滴平均粒径最小，为1.17 μm。这说明固定化菌在处理原油污染地下水时，更有利于原油以小粒径分散的油滴存在[36]，而不是以大片的油膜存在于地下水中，从而使地下水中的油更容易与微生物接触而被降解。与原油相似，柴油经活性炭固定化菌处理后Zeta电位由-28.13 mV降至-17.07 mV，油滴平均粒径为3.45 μm。这说明在微生物作用下，柴油以细小粒径的分散油滴状态存在，有利于其与微生物接触而被降解。

表5 添加不同物质对石油污染地下水Zeta电位及分散油滴粒径的影响

2.4.2 烃类组分表征结果

气相色谱-质谱分析结果显示柴油和委内瑞拉原油中正构烷烃主要是n-C9～n-C33，多环芳烃(PAHs)则主要有萘、菲、芴、蒽、芘和二苯并噻吩等。地下水中的原油和柴油分别经活性炭、游离菌和固定化菌修复后各烃类组分含量均有不同程度的降低(见图6)，固定化菌对地下水中的石油烃组分具有很好的吸附、降解作用。

N—Naphthalene；P—Phenanthrene；A—Anthracene；PY—Pyrene；D—Dibenzothiophene；F—Fluorene；C—Chrysene

对于原油，活性炭固定化菌对n-C9～n-C33有明显的去除作用，修复后正构烷烃组分含量最低(见图6(a1))；而对于柴油，游离菌降解后正构烷烃组分含量最低(见图6(b1))，这可能是由于游离菌对柴油有更好的分散作用。从图6(a2)可以看出，活性炭吸附以及固定化菌修复均对地下水中原油多环芳烃具有很好的去除作用。经计算，活性炭、游离菌和活性炭固定化菌分别去除了原油中31.08%、44.98%、63.84%的正构烷烃和68.37%、48.81%、84.65%的多环芳烃，分别去除了柴油中12.72%、45.63%、25.76%的正构烷烃和64.38%、58.74%、64.33%的多环芳烃。固定化菌对原油中正构烷烃和多环芳烃的去除率比游离菌分别提高18.86和35.84百分点。因此，活性炭固定化显著提高了降油菌群对地下水中烃类组分尤其是多环芳烃组分的去除率。

3 结 论

(1)通过批量实验从油污土壤中筛选出高效降油菌铜绿假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa)HL与沙门氏菌属(Salmonellasp.)L4菌株复配，在温度15 ℃、转速120 r/min条件下通过生物降解对初始油浓度为1000 mg/L的地下水中原油去除率为21.33%；采用吸附法固定于椰壳颗粒活性炭，固定化菌量为1.18×1011cell/g。

(2)固定化菌在温度15 ℃时，固定化菌投加量1.0 g/L、油质量浓度1000 mg/L、pH值为7的最优条件下对低温地下水中原油和柴油的去除率分别为85.02%和74.53%；对原油污染地下水中的正构烷烃和多环芳烃的去除率比游离菌分别提高18.86和35.84百分点。

(3)固定化菌通过快速吸附地下水中的石油，增加微生物和石油之间的接触，从而增加微生物对溢油的降解和地下水中石油的去除率，对于低温条件油污地下水的修复是一种经济、高效又低碳的处理方式。