硫利达嗪对胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响及机制探讨

罗娜　倪猛　刁云辉

摘要：目的 探討硫利达嗪（TDZ）对胰腺癌细胞SW1990增殖、凋亡的影响及其对LINC00470的调控作用。方法 用不同浓度（5、10、20 μmol/L）的TDZ处理人胰腺癌细胞SW1990，si-NC（si-NC组）、si-LINC00470（si-LINC00470组）转染至SW1990细胞，分别将pcDNA（TDZ+pcDNA组）、pcDNA-LINC00470（TDZ+pcDNA-LINC00470组）转染至SW1990细胞后加入TDZ处理细胞；MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖及克隆形成能力；流式细胞术检测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR检测LINC00470的表达量；Western blot检测活化的胱天蛋白酶（cleaved-caspase）3、cleaved-caspase9蛋白表达。结果 与对照组比较，TDZ不同剂量组SW1990细胞增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，细胞克隆形成数减少，LINC00470的表达量降低（P＜0.05）。与si-NC组比较，si-LINC00470组SW1990细胞增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，细胞克隆形成减少（P＜0.05）。转染pcDNA-LINC00470可逆转TDZ对SW1990细胞增殖、凋亡及克隆形成的作用。结论 TDZ可通过抑制LINC00470的表达而抑制胰腺癌细胞增殖、克隆形成及诱导细胞凋亡。

关键词：胰腺肿瘤；硫利达嗪；细胞增殖；细胞凋亡；RNA，长链非编码；LINC00470

中图分类号：R735.9，R979.1文献标志码：ADOI：10.11958/20220932

The effect of Thioridazine on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells

LUO Na NI Meng DIAO Yunhui

1 Department of Western Medicine， 2 Department of Gastroenterology， Nanyang Central Hospital， Nanyang 473000， China

Abstract： Objective To explore the effect of thioridazine （TDZ） on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells SW1990 and its regulatory effect on LINC00470. Methods Different concentrations of TDZ （5， 10 and 20 μmol/L） were used to treat human pancreatic cancer cells SW1990. si-NC and si-LINC00470 were transfected into SW1990 cells （the si-NC group and the si-LINC00470 group）. After transfecting pcDNA and pcDNA-LINC00470 into SW1990 cells， TDZ were added to treat cells （the TDZ+pcDNA group and the TDZ+pcDNA-LINC00470 group）. MTT， plate clone formation test were used to detect cell proliferation and clone formation ability. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. The real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression level of LINC00470. Western blot assay was used to detect expression levels of activated aspartate specific cysteine protease （cleaved-caspase） 3 and cleaved-caspase9. Results Compared with the control group， the cell proliferation inhibition rate， apoptosis rate， cleaved-caspase3 and cleaved-caspase9 protein levels of SW1990 cells were increased， the number of cell clone formation was decreased， and the expression level of LINC00470 was decreased in the different dose TDZ groups （P＜0.05）. Compared with the si-NC group， the cell proliferation inhibition rate， apoptosis rate， cleaved-caspase3 and cleaved-caspase9 protein levels of SW1990 cells were increased in the si-LINC00470 group， and the cell clone formation was reduced （P＜0.05）. The transfection of pcDNA-LINC00470 could reverse the effect of TDZ on cell proliferation， apoptosis and colony formation of SW1990 cells. Conclusion TDZ can inhibit the proliferation， clone formation and induce apoptosis of pancreatic cancer cells by inhibiting the expression of LINC00470.

Key words： pancreatic neoplasms; Thioridazine; cell proliferation; apoptosis; RNA， long noncoding; LINC00470

胰腺癌是一种消化系统恶性肿瘤，发病率与病死率较高。研究显示，胰腺癌早期患者症状不明显，大部分患者确诊时已处于晚期，5年生存率较低［1］。由于缺乏有效的治疗方式，大多数胰腺癌患者死于癌症进展，因此寻找安全有效且可抑制胰腺癌细胞增殖及转移的药物至关重要［2］。硫利达嗪（TDZ）属于哌啶类衍生物，其在早期主要用于治疗精神分裂等精神疾病，后来发现其亦有抗肿瘤作用，有望成为新型抗肿瘤药物［3］。目前，有关TDZ与胰腺癌的相关研究报道较少。研究显示，长链非编码RNA（LncRNA）在肿瘤中异常表达，其中LINC00470在胃癌组织和细胞中表达上调，可促进胃癌的发生及发展［4］。然而，鲜见LINC00470在胰腺癌中作用的相关研究。本研究旨在探讨TDZ可否通过调控LINC00470表达而影响胰腺癌SW1990细胞的增殖及凋亡，以期为治疗胰腺癌提供新的临床靶向药物。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 TDZ（纯度≥98%）购自美国Sigma公司；人胰腺癌细胞SW1990购自上海通派生物科技有限公司；MTT试剂购自上海碧云天生物有限公司；凋亡检测试剂盒、Lipofectamine2000购自北京索莱宝科技有限公司；si-NC、si-LINC00470购自广州锐博生物技术有限公司；pcDNA3.1购自上海生工生物工程股份有限公司；pcDNA-LINC00470购自上海吉满生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录与实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）试剂购自北京天根生化科技有限公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶3（cleaved-caspase3）、活化的胱天蛋白酶9（cleaved-caspase9）抗体、内参GAPDH抗体与二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组 按照4×103个/孔将SW1990细胞接种于96孔板，分别加入含有5 μmol/L（TDZ低剂量组）、10 μmol/L（TDZ中剂量组）、20 μmol/L（TDZ高剂量组）TDZ的培养液培养24 h［5］。将未经处理的SW1990细胞置于DMEM完全培养基内培养24 h（对照组）。用脂质体Lipofectamine2000分别将si-NC（si-NC组）、si-LINC00470（si-LINC00470组）转染至SW1990细胞。分别将pcDNA（TDZ+pcDNA组）、pcDNA-LINC00470（TDZ+pcDNA-LINC00470组）转染至SW1990细胞后，加入含有20 μmol/L TDZ的培养液培养24 h。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取1.2.1各组SW1990细胞，按照每孔3 000个细胞的密度接种于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，培养4 h后弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，室温避光孵育10 min后用酶标仪检测各孔450 nm波长处光密度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。每次设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成数 取1.2.1每组SW1990细胞（1×103个/孔）接种于6孔板，培养36 h后收集细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，加入含有体积分数10%的胎牛血清且不含抗生素的培养液，将细胞接种于12孔板（100个/孔），于培养箱内继续培养2周。用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%结晶紫染色1 min，显微镜下计数每个视野各孔的细胞克隆形成数。每次设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 取1.2.1中处理后的各组SW1990细胞，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞后加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC），充分混匀后加入5 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育10 min后用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。每次设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.5 qRT-PCR检测LINC00470相对表达水平 用Trizol试剂提取1.2.1中每组SW1990细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作，用逆转录试剂盒将RNA合成cDNA。以cDNA为模板配置qRT-PCR反应体系：cDNA 4 ?L，上下游引物各0.4 ?L，SYRB Mix 10 ?L，ddH2O 5.2 ?L，共20 ?L。用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增。反应条件：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算LINC00470相对表达水平。引物序列依据参考文献［6］设计，LINC00470：上游5′-AGACACAGCCTCTACTGTACT-3′，下游5′-CCTCGTCACCTTACGTCAATAC-3′；β-actin：上游5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游5′-AGGGAGGAGCTGGAAGCAG-3′。每次设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达 将1.2.1中每组SW1990细胞充分裂解后离心吸取上清液，提取细胞总蛋白，蛋白与上样缓冲液充分混合后加热，促使蛋白变性，依次用5%浓缩胶和10%分离胶进行SDS-PAGE。转膜后用5%脱脂牛奶阻断膜，加入cleaved-caspase3（1∶1 000）、cleaved-caspase9（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）一抗孵育过夜，清洗后加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，用ECL化学发光试剂盒檢测蛋白，用凝胶系统全自动化学发光成像仪分析结果。每次设置3个复孔，实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TDZ对胰腺癌SW1990细胞增殖的影响 与对照组比较，TDZ低、中、高剂量组细胞增殖抑制率依次升高，细胞克隆形成数依次降低（P＜0.05），见图1、表1。

2.2 TDZ对胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响 与对照组比较，TDZ低、中、高剂量组细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平依次升高（P＜0.05），见图2、3，表2。

2.3 TDZ对胰腺癌SW1990细胞LINC00470表达的影响 对照組、TDZ低剂量组、TDZ中剂量组、TDZ高剂量组LINC00470相对表达水平分别为（1.00±0.00）、（0.79±0.05）、（0.59±0.05）、（0.42±0.04）。与对照组比较，TDZ低、中、高剂量组LINC00470的表达量依次降低（n＝9，F＝342.909，P＜0.05）。

2.4 干扰LINC00470表达对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组比较，si-LINC00470组细胞增殖抑制率升高，细胞克隆形成数减少，凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白相对表达水平升高（P＜0.05），见图4、5，表4。

2.5 LINC00470过表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的作用 与TDZ+pcDNA组比较，TDZ+pcDNA-LINC00470组细胞增殖抑制率降低，细胞克隆形成数增多，凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图6、7，表5。

3 讨论

TDZ影响多种癌细胞的增殖和凋亡。研究显示，TDZ可抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡［7］。TDZ可通过调控肿瘤细胞凋亡，从而增强肺癌和卵巢癌细胞的顺铂敏感性［8］。TDZ可抑制鼻咽癌细胞增殖［9］。本研究结果亦显示，低、中、高剂量TDZ均可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖，并降低胰腺癌SW1990细胞克隆形成数，尤其是TDZ高剂量具有抗胰腺癌增殖的作用。癌细胞的异常凋亡会激活体内线粒体途径，使caspase3、caspase9活化为cleaved-caspase3、cleaved-caspase9，加速癌细胞凋亡的发生［10-11］。本研究结果显示，随着TDZ浓度的不断增加，胰腺癌SW1990细胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平均依次升高，表明不同剂量TDZ均能上调cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达，并提高胰腺癌SW1990细胞凋亡率，尤其是高剂量组促凋亡作用更为明显，但TDZ调控胰腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制仍需进一步探究。

LncRNA是哺乳动物转录组的主要组成部分，其作为肿瘤治疗潜在靶点的高效应用已受到广泛关注［12］。研究表明，LINC00470可通过调控miR-134/Myc分子轴而促进神经胶质瘤细胞迁移及侵袭［13］。LINC00470在肝细胞癌中呈高表达，并可促进肝癌细胞增殖［14］。本研究结果显示，干扰LINC00470表达后胰腺癌SW1990细胞增殖抑制率升高，克隆形成数减少，SW1990细胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，表明干扰LINC00470表达可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖并促进其凋亡，提示LINC00470可能在胰腺癌细胞进展中发挥重要作用。此外，本研究发现，随着TDZ浓度的增加，胰腺癌SW1990细胞中LINC00470的表达量依次降低，提示TDZ可能通过抑制LINC00470的表达而发挥抗胰腺癌SW1990增殖和促进其凋亡的作用。为进一步证实TDZ与LINC00470在胰腺癌细胞增殖和凋亡中的调控关系，本研究在过表达LINC00470的基础上对胰腺癌SW1990细胞进行TDZ干预，结果提示LINC00470过表达能够拮抗TDZ对胰腺癌细胞增殖及凋亡的作用。

综上所述，TDZ可通过下调LINC00470表达来抑制胰腺癌细胞增殖，并促进其凋亡。LncRNA常通过调控下游miRNA水平影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而介导LINC00470功能的下游靶miRNA尚需进一步预测和验证。本研究初步论证了TDZ对胰腺癌细胞生物学行为的影响，为胰腺癌药物的研发提供新方向，为进一步揭示TDZ抗胰腺癌作用奠定了实验基础。

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（2022-06-21收稿 2022-09-20修回）

（本文編辑 陆荣展）