有氧运动改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的机制分析

叶和江 王巧云 田学敏 王保健

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）为常见呼吸系统疾病，目前40 岁以上人群的COPD 患病率已达15%左右［1］。气道炎症反应是COPD 发生、发展的重要机制，可引发炎症性损害并伴随免疫系统的激活［2］。研究发现，有氧运动可抑制烟雾暴露小鼠肺组织的炎症因子表达，抑制气道上皮增生，但运动改善COPD 慢性炎症的具体机制仍不明确［3-4］。趋化素（chemerin，CHEM）/趋化因子受体-1（CMKLR1）与COPD 有密切关联，通过募集气道内白细胞而发挥促炎作用，与COPD 预后密切相关［5］。运动被认为可促进肺功能的改善［6］，且推测运动对COPD 肺功能的影响可能与CHEM/CMKLR1 有关。本研究以斯泼累格•多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠进行研究，探究有氧运动改善COPD 肺功能的初步机制，旨在为临床COPD 的运动疗法提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠（新疆医科大学动物实验中心），共30 只，动物毛色光泽，无受损、断尾现象，食水摄入正常，自由饮水和进食。

1.1.2 实验仪器 自制静式被动吸烟箱（1 m×1 m×0.8 m）；肺功能检测系统（BH-AX-MAPG，广州红象医疗科技有限公司）；石蜡包埋机（HS-B7126-B，沈阳恒松科技有限公司）与切片机（RM2235，德国Leica）；光学显微镜（BX53F，日本OLYMPUS）；小型垂直电泳槽与小型Trans-Blot 转印槽（美国伯乐公司）；组织匀浆器（S-18KS，北京莱普特科学仪器有限公司）；高速台式离心机（LC-LX-H165A，上海力辰仪器科技有限公司）；电热恒温培养箱（GHP-9080，上海一恒科学仪器有限公司）；全波长酶标仪（美国Thermo scientific）。

1.1.3 实验试剂 二甲苯、无水乙醇、苏木素和伊红染色液（均为上海生工生物工程）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；中性树胶、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、一抗及二抗稀释液、GAPDH/β-actin 内参、HRP 标记二抗（均为北京深蓝云生物科技有限公司）；CHEM、CMKLR1、CXCL8/IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6 抗体（美国abcam）。

1.2 实验方法

1.2.1 建立COPD 大鼠模型 通过香烟暴露构建COPD 模型：将SD 大鼠置于被动吸烟箱，用抽吸电机对20 只香烟（大前门牌）自动吸烟并将烟雾注入吸烟箱使大鼠被动吸烟，吸烟箱氧气浓度控制>18%，一氧化碳浓度保持在（345±35） ppm，烟熏刺激16 周。模型判定：以大鼠肺组织HE 染色呈COPD 特征（炎症细胞浸润、气道狭窄及粘液增多）为COPD 大鼠模型制备成功［7］。

1.2.2 有氧运动 将30 只COPD 大鼠随机分为对照组和运动组，运动组予以跑台运动：采取中等强度的有氧运动（13.3 m/min），第1 周进行适应性训练，每天10 min，每周3 d；第2～9 周为正式训练，每天40 min，3天/周，共9 周；对照组不干预。

1.2.3 动物取材 称量大鼠体重并记录结果。腹腔注射10%水合氯醛溶液，5 min 后检测肺功能。处死大鼠，取右肺组织，清洗后剪成2 部分，分别用于苏木精－伊红染色和Western-blot 检测。

1.2.4 肺功能检测 暴露大鼠颈部皮肤，消毒，于气管软骨环下方剪一小口行气管插管，气管插管末端连接肺功能检测系统，操作电脑软件获取第1 秒用力呼气量（forced expiratory volume in one second，FEV1）、用力呼气量（forced vital capacity，FVC）、最大呼气中段流速（maximal mid-expiratory flow，MMEF）、呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）等参数。

1.2.5 肺组织苏木精－伊红染色 ①石蜡包埋：用镊子固定组织，持手术刀垂直切断组织，后放入流水过夜。按75%（45 min）、85%（45 min）、95%（10 min）、100%（5 min）酒精的顺序进行梯度脱水。依次加入无水乙醇＋二甲苯（20 min）、二甲苯Ⅰ（10 min）、二甲苯Ⅱ（10 min）进行透明。浸蜡后于包埋器内注入高熔点石蜡，用镊子将组织移到包埋器内中间位置。待石蜡凝固后去除包埋器，置于4℃下保存。②染色：切除边缘余蜡后切片，乙醇梯度脱水，苏木精染液染4 min，流动水清洗；85%酒精、95%酒精脱水各5 min，伊红染液中染色5 min，最后乙醇梯度脱水后中性树胶封片。

1.2.6 Western blot 法检测蛋白表达 ①制备组织蛋白上清液：剪碎组织，加入酶抑制剂三联装，按每20 mg 组织加100 μL 裂解液的比例加入裂解液。离心机12 000 r/min 离心5 min 留取上清液。②上清液蛋白浓度：BCA 蛋白定量试剂盒制成工作液待用；稀释BSA 标准品成8 个浓度梯度。每管加上清液100 μL 后加2 mL 工作液，孵育0.5 h后检测562 nm 处光密度值。制作标准曲线，计算样品总蛋白浓度。③肺组织的各蛋白表达：灌胶、电泳后转印蛋白，BSA 中封闭PVDF 膜2 h，洗膜；加稀释的CHEM、CMKLR1、白细胞介素8（interleukin 8，IL-8）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和GAPDH，孵育过夜。与HRP 标记的二抗反应，孵育，显影、定影。

1.3 统计学方法 采用GraphPad 8.0 进行统计，正态分布计量资料用表示，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 苏木精－伊红染色结果 对照组的肺组织可见炎症细胞浸润，气道黏液增加，为慢性支气管炎特征；肺泡结构被破坏，间隔破裂融合为肺大疱，为肺气肿特征，见图1（A）。运动组的肺组织可见支气管周围炎症浸润与黏液分泌、黏膜增生减少，管壁变薄，肺泡结构破坏减轻，见图1（B）。

图1 大鼠肺组织苏木精－伊红染色（×200）

2.2 肺功能指标比较 运动组大鼠MMEF、PEF 高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组FEV1、FVC差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组大鼠肺功能指标比较（）

表1 两组大鼠肺功能指标比较（）

注：FEV1为第1s用力呼气量；FVC为用力呼气量；MMEF为最大呼气中段流速；PEF为呼气峰流速。

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2.3 大鼠肺组织CHEM、CMKLR1 蛋白表达水平比较 运动组大鼠肺组织CHEM 蛋白表达高于对照组，CMKLR1 表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表2。

表2 大鼠肺组织CHEM、CMKLR1蛋白表达水平比较（）

表2 大鼠肺组织CHEM、CMKLR1蛋白表达水平比较（）

注：CHEM为趋化素；CMKLR1为趋化因子受体-1。

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图2 两组大鼠肺组织CHEM、CMKLR1的蛋白免疫印迹

2.4 大鼠肺组织炎症因子蛋白表达水平水平比较运动组大鼠肺组织IL-1β、IL-8 蛋白表达低于对照组（P<0.05）；运动组大鼠肺组织IL-6 和TNF-α 蛋白表达与对照组比差异无统计学意义（P>0.05）。见图3、表3。

表3 大鼠肺组织IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达水平比较（）

表3 大鼠肺组织IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达水平比较（）

注：IL-8为白细胞介素-8；TNF-α为肿瘤坏死因子-α；IL-1β为白细胞介素-1β；IL-6为白细胞介素-6。

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图3 两组大鼠肺组织IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6 的蛋白免疫印迹

3 讨论

3.1 有氧运动对COPD 大鼠肺组织炎症因子的影响本研究结果显示，运动组大鼠肺组织IL-1β、IL-8 蛋白表达低于对照组（P<0.05），提示有氧运动可抑制COPD 大鼠肺组织的IL-1β、IL-8 蛋白表达。香烟烟雾是有效的促炎剂，其中的有毒颗粒可穿过肺泡-毛细血管界面并进入全身血流循环，激活促炎细胞因子产生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎性因子［8-9］。COPD 涉及许多不同类型的炎性细胞，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等，肺组织IL-1β、IL-8 等分泌的增加会释放更多的炎性介质，形成复杂网络作用，共同诱发并加重COPD 慢性炎症［10-11］。研究表明，C57BL/6J 小鼠香烟暴露后进行耐力运动干预可降低血浆中炎症细胞因子，发挥明显抗炎作用［12］，与本研究结论一致。有氧运动可减轻由烟暴露引起的促炎反应和全身循环中细胞浸润［13］，提示有氧运动可减轻COPD 小鼠的肺部炎症和重塑反应。分析原因，有氧运动可大幅提高气道气流，缓解细小支气管的浸润，促进气道舒张与阻力减小，提高肺组织弹性，缓解肺气肿与肺组织的炎性介质沉积，对肺组织的炎症反应发挥抑制作用，进而减少了肺组织IL-1β、IL-8 分泌与表达［14］。此外，有氧运动可减少机体循环中炎症细胞因子，减轻全身及局部炎症。

3.2 有氧运动对COPD 大鼠肺功能的影响 本研究结果显示，运动组大鼠MMEF、PEF 高于对照组（P<0.05），提示有氧运动可在一定程度上改善COPD 大鼠肺功能。国外研究认为，运动疗法可作为COPD 的非药物干预手段，通过抑制炎症反应来改善肺功能［15］，与本研究结论一致。分析原因，有氧运动可缓解胸膜与肺泡压力，减小呼吸道阻力，延缓支气管周纤维化及气道壁增厚，使肺功能得以改善［16-17］。此外，有氧运动对肺组织炎症反应的抑制作用也是改善肺功能的途径之一，随着有氧运动对炎症的抑制，肺组织中炎性介质的沉积减少，气道壁增厚与管腔变窄也能得到改善，进而增强肺部呼吸功能。有氧运动还能减轻机体应激，缓解因应激引起的肺功能障碍［18-19］。

3.3 有氧运动对CHEM/CMKLR1 的调控作用 本研究结果显示，运动组大鼠肺组织中CHEM 蛋白表达高于对照组，CMKLR1 表达低于对照组（P<0.05），提示有氧运动可促进大鼠肺组织CHEM 蛋白表达并抑制CMKLR1 表达。CHEM/CMKLR1 被认为是有氧运动调控炎症反应的通路之一，其中CHEM 主要通过内吞噬作用减少中性粒细胞炎症并抑制炎性细胞因子释放，发挥抗炎作用；而其受体CMKLR1 则可使树突细胞和巨噬细胞迁移，募集炎症因子、促进炎症发展，发挥促炎作用［20-21］。因此CHEM/CMKLR1 的平衡是调控炎症反应的关键，当CHEM 表达上调而CMKLR1 表达下调时，抗炎作用占主导；CHEM 表达下调而CMKLR1 表达上调时，促炎作用占主导［22-23］。有氧运动对COPD 大鼠肺组织CHEM 表达的促进作用及对CMKLR1 表达的下调作用，考虑与有氧运动减少了气道CHEM 蛋白消耗，从而减弱了CMKLR1 趋化作用有关，在较大程度上避免了促炎细胞因子及炎性细胞在肺部大量积聚，是有氧运动调节COPD 炎症反应的信号通路之一［24-25］。

本研究不足之处：①CHEM/CMKLR1 通路只是有氧运动调控肺部炎症的其中一个信号通路，尚有其他涉及的信号通路及作用机制仍有待发现与探讨；②本次仅初步确认了CHEM/CMKLR1 参与有氧运动调控大鼠肺组织炎症反应的过程，但具体的调控过程仍有待在分子生物学水平上进行探讨；③有氧运动的类型较多，运动方式及运动时间、运动量对COPD 的影响也有待进一步分析，从而为COPD 患者的有氧运动辅助治疗方案提供参考。

综上所述，有氧运动可通过对CHEM/CMKLR1 表达的影响抑制炎症反应，改善COPD 大鼠的肺功能。