醇溶性和水溶性伊红在活检小组织标本预染上的应用比较

熊红梅，卓小花，邱晓明

近年各种内镜及细针穿刺活检小组织标本越来越多，由于取材的局限性，取材组织数量少、体积小，给技术员在制片过程中带来困难。目前国内外对于小标本的预处理方法不尽相同，有酸化的伊红液[1]、未酸化的伊红液、伊红-固定液[2]等预染法，均采用水溶性伊红配成的各种预染液。由于试剂配置方法、剂量等均无统一标准，采用常规的伊红滴染法效果不佳。为了增加组织的肉眼识别度，提高包埋、切片的速度和质量，笔者在日常外检工作中采用醇溶性伊红在脱水中对活检小标本进行预染，取得满意效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年1月福建省龙岩市第一医院病理科胃肠镜、阴道镜活检标本及肺、乳腺、前列腺穿刺组织标本合计200例，直径均小于0.3 cm，随机分成2组：水溶性伊红预染法组、醇溶性伊红预染法制作组，每组各100例。标本取材均使用相同规格的正方形包埋纸，应用相同的折叠方式包裹组织防止漏检，两组均用樱花Vip5脱水机，常规固定、脱水、透明，水溶性及醇溶性伊红粉剂购自上海试剂三厂。

1.2 试剂0.5%水溶性伊红配置：0.5 g水溶性伊红溶于100 mL蒸馏水。0.05%醇溶性伊红配置：1.75 g醇溶性伊红溶于脱水机第1道3 500 mL无水乙醇中。

1.3 方法(1)水溶性伊红预染法：取材时用0.5%水溶性伊红滴1～2滴于每一例组织上，再用包埋纸包好后放入包埋盒，入脱水机处理。(2)醇溶性伊红预染法：取材时不滴染伊红，直接包埋纸包好放入包埋盒，入脱水机处理，在换脱水液时在第1道3 500 mL无水乙醇中加入1.75 g醇溶性伊红，稍搅伴溶解均匀，直到下一次更换脱水液时为止。本科室每天检测150～200个活检小标本，使用1个月，中间无需添加伊红。两种方法均使用相同机器和流程，脱水时间12 h，比较组织的肉眼识别度及镜下HE染色结果。

1.4 结果判定根据蜡块组织标准进行评判[2]，包埋时肉眼观察活检小组织：鲜红色为()，淡红色为(+)，极微弱红色或完全不着色为(-)。镜下评判标准根据《临床技术操作规范·病理学分册》进行染色评判。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法在脱水后的组织着色对比水溶性伊红滴染的胃肠镜活检标本及阴道镜子宫颈活检标本均有不同程度的褪色，包埋时呈淡红色，穿刺组织呈微弱或完全不着色，包埋后组织与石蜡对比不明显，识别度较低。醇溶性伊红预染法各种活检小标本均呈鲜红色，包埋时组织与石蜡对比鲜明，明显优于水溶性伊红滴染法(P<0.001，表1，图1～6)。

图1 水溶性伊红预染法：穿刺组织，不着色 图2 醇溶性伊红预染法：穿刺组织，鲜红色 图3 水溶性伊红预染法：胃组织，不着色 图4 醇溶性伊红预染法：胃组织，鲜红色 图5 水溶性伊红预染法：子宫颈组织，微弱红色 图6 醇溶性伊红预染法：子宫颈组织，鲜红色 图7 水溶性伊红预染法：胃组织，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，红细胞呈鲜红色 图8 醇溶性伊红预染法：胃组织，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，红细胞呈鲜红色

表1 两种方法脱水后的组织着色对比

2.2 两种方法组织结构对比镜下观察两种方法制作切片的HE染色，结果显示组织均结构完整，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，红细胞呈鲜红色，对比清晰，染色效果无明显差异(图7、8)。

3 讨论

临床病理工作中，取材医师肉眼观察活检小标本直径为0.01～0.2 cm，呈点状或米粒状。穿刺组织呈条索状，由于体积小，标本又极其珍贵，若预染不当，包埋时组织与石蜡颜色相近，不易识别，易造成遗漏或丢失现象。常规方法在取材时逐个滴染水溶性伊红，组织经脱水机第一缸10%中性福尔马林固定及梯度乙醇脱水后均有不同程度脱色，导致包埋时颜色淡或不着色。由于伊红是酸性染料，组织成分的等电点3.3～5.2，着色后的组织经10%中性福尔马林固定，pH>5.0，伊红的结合能力下降，染液结合牢度减弱，在乙醇脱水过程中易快速褪色[3]。醇溶性伊红预染法将组织浸泡在脱水的第1道无水乙醇中30 min，再经二道无水乙醇脱水。因此醇溶性伊红预染法与水溶性伊红预染法相比，其优点如下：(1)易识别、醒目，提高包埋、切片的速度与质量，不致于过切或少切，提高制片效率。水溶性伊红预染法属于滴染法，醇溶性伊红预染法属于浸染法，有学者研究使用水溶性伊红的浸染固定法与滴染法之间着色差异无显著性[4]，但浸染法与滴染法的制片时间差异有显著性[4]。醇溶性伊红预染法是将醇溶性伊红加入无水乙醇中，不易脱色。伊红浸染固定法是将水溶性伊红加入10%中性福尔马林，将组织浸泡在含伊红的固定液中固定，再经后续的各级浓度乙醇脱水后，乙醇会使已染上伊红的组织不同程度脱色，此水溶性伊红浸染固定法与水溶性伊红滴染法着色无显著性，醇溶性伊红浸染法与水溶性伊红滴染法着色差异有显著性。(2)节省试剂用量及配制时间，水溶性伊红预染法所需的伊红试剂多、浓度高，配制较麻烦，醇溶性伊红预染法无需另外配制，只需在脱水无水乙醇试剂内按0.05%浓度直接加入醇溶性伊红粉剂，试剂用量少，配制简单。(3)缩短取材时间，减少工作流程，提高工作效率。无论是不同酸类酸化或未酸化水溶性伊红滴染法[1]或苏木精滴染法[4]，取材时每例均滴上1～2滴预染液，耗时，影响取材速度，对于活检小标本工作量大的单位尤其不适用。尽管有些学者用0.4%伊红-福尔马林固定液[2]或0.15%苏木精-福尔马林固定液[4]对活检小标本浸染固定法均能获取良好的效果，但需增加浸染的时间和流程。醇溶性伊红预染法无需额外增加时间和工作流程，在脱水中预染，明显提高工作效率。(4)脱水机堵管：丁伟等[3]报道将伊红加入95%或无水乙醇中，使用时间久后，可能会引起伊红在脱水机管路中沉淀、累积，导致机器堵塞，笔者经2年实践，将醇溶性伊红加入无水乙醇中并未发现堵管现象。按本科室每天150～200个蜡块工作量，使用1个月后更换脱水试剂时用乙醇计测得第1道无水乙醇浓度降为96%，第1道95%乙醇浓度降为80%，第2道95%乙醇浓度降为90%。第1道无水乙醇浓度降为96%能使0.05%醇溶性伊红彻底溶解，缸底未发现有伊红沉淀现象。如果将醇溶性伊红加入脱水的第1道或第2道95%乙醇，会出现少许沉淀现象。文献报道[5]将少许伊红加入80%脱水乙醇中使活检小标本染上伊红色，由于醇溶性伊红在低浓度乙醇中溶解度低，随着脱水液使用周期延长，乙醇浓度下降易导致堵管现象的发生。因此，为防止脱水机故障，将伊红加在第1道无水乙醇中为佳。

总之，用酸化伊红液滴染[1]、苏木精滴染、苏木精浸染固定法[4]进行预染，均取得良好效果。本科室使用醇溶性伊红预染法切片颜色鲜艳，效果稳定，非常方便，值得临床推广应用。