不同酸类酸化的伊红溶液在病理活检小标本预染色中的应用研究

李金龙，马叶艳，张旭东，宋 欣,马亚琪

（1.中国人民解放军总医院第一医学中心病理科，北京 10086；2.长治医学院基础医学部，山西长治 046000）

活检小标本的包埋制作是病理技术工作中的一大难题。由于取材的局限性，取材组织数量少、体积小给技术员在制片过程中带来了一定的困难[1]。虽然目前国内外对于小标本的预处理方法不尽相同，但大多都是采用不同酸类溶液酸化的伊红溶液进行脱水前或（和）脱水中滴染的方法进行标本的预染色，然而由于试剂的易得程度、配置方法、滴加剂量等方面都没有一个统一标准的方案，大多数单位的小标本的预处理效果并不令人满意，由此给后续的常规及免疫组化（或分子病理）等过程造成了较大的影响，在此，笔者通过对三组常规小标本分别滴加水溶性伊红溶液、醋酸化伊红溶液和盐酸化的伊红溶液进行预染色的方法，对比脱水后三组蜡块的肉眼颜色区别及制片后的镜下颜色区别，对比分析不同酸类酸化的伊红溶液对小标本预染色的效果。

1 材料与方法

1.1 研究对象 从解放军总医院病理科的日常病理标本中随机选取组织直径均小于0.5cm的胃肠镜活检组织和穿刺组织标本共计90例，均分为3组，每组30例，均由中性福尔马林溶液固定。本实验选用的组织标本必须符合以下标准：（1）正常临床活检的标本；（2）组织标本均采用中性福尔马林溶液固定，符合临床试验的相关要求。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 实验试剂 ：0.810g/cm3的乙醇溶液，伊红染液，盐酸酒精溶液，氨水溶液，盐酸溶液，冰醋酸溶液等均由实验室按照标准操作配置，水溶性伊红 Y 粉剂、中性福尔马林溶液、无水乙醇等其他试剂均购自国药，分析纯。

1.2.2 仪器设备：全自动组织脱水机 LEICA ASP200S，包埋机，冷冻台，切片机，水浴展片机，烤片机，罗氏VENTANA HE 600全自动染色系统，显微镜等。

1.2.3 不同伊红溶液试剂配制[2-4]：①水溶性伊红溶液：将1 g伊红Y粉剂溶于少许蒸馏水中，用玻璃棒搅拌溶解后，加蒸馏水至100 ml。②冰醋酸化伊红溶液：将1 g伊红Y粉剂溶于少许蒸馏水中,用玻璃棒搅拌溶解后,加蒸馏水至100 ml,充分搅拌后加冰醋酸至pH值5～6之间。③盐酸化伊红溶液：伊红Y用蒸馏水充分溶解加浓盐酸10 ml，搅拌均匀，放置过夜，析出沉淀，用滤纸过滤，滤液不要，沉淀物与滤纸一起放恒温箱干燥，用0.810g/cm3的乙醇1 000 ml配成沉淀酸化伊红Y乙醇储存液，临用时，取饱和液1份，加0.810g/cm3的乙醇2份，配成工作液，待用。

1.3 方法

1.3.1 组织脱水：将固定好的活检组织小标本由医生取材完毕后，分成三组，每组均为30例，共计90例，分别滴加冰醋酸化伊红溶液、盐酸化伊红溶液及对照水溶性伊红溶液，然后放入同一脱水机进行脱水。

1.3.2 组织包埋、修块

1.3.3 切片、捞片与烤片

1.3.4 组织常规HE染色：染色均使用罗氏VENTANA HE600全自动滴染氏染色机进行染色，排除染色染液污染和染色力等影响因素，染色效果均一稳定，染色玻片间无交叉污染[5]。

1.3.5 镜下观察及肉眼观察：将染好的切片置于镜下观察、对比；将制成的蜡块进行肉眼观察并按判定标准评分。

1.3.6 评分标准 ：根据蜡块组织判定标准进行评判，判定标准[6]：组织呈鲜红色判定为（++），组织呈淡红色判定为（+），无伊红着色判定为（-）；

镜下评判标准依据《临床技术操作规范-病理学分册》中对于细胞核、细胞质染色以及交叉污染的评分标准进行判读。

1.4 统计学分析 采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，组间比较采用秩和检验分析。P＞0.05，差异无统计学意义；P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组蜡块着色比较 脱水后进行组织包埋观察：水溶性伊红溶液滴染组组织着色较淡，不易识别，包埋后组织与石蜡对比不明显，冰醋酸化伊红溶液组和盐酸化伊红溶液组滴染组织着色均较深，易识别，包埋后组织与石蜡对比明显。盐酸化伊红溶液组呈鲜红色的共28例，淡红色的2例；醋酸化伊红溶液组呈鲜红色的共27例，淡红色的3例；水溶性伊红溶液组呈鲜红色的共20例，淡红色的6例，无伊红着色4例；经脱水包埋后，肉眼观察蜡块着色情况按评分标准评判，分析数据后可得：盐酸化伊红溶液组着色鲜明且没有脱色，与水溶性伊红溶液组比较差异有统计学意义（χ2=6.923，P=0.009）；醋酸化伊红溶液组着色鲜明且没有脱色，与水溶性组比较伊红溶液有统计学意义（χ2=5.221，P=0.022）；盐酸化伊红溶液组和醋酸化伊红溶液组均着色鲜明没有脱色，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.215，P=0.643）。常规组织染色后，镜下观察三种溶液滴染的组织切片，发现其组织结构均清晰，颜色对比分明，三者之间无明显区别(图1～3)。统计学分析结果显示：盐酸化伊红溶液组与醋酸化伊红溶液组相比，蜡块着色无明显差异(P＞0.05)，结果无统计学意义，其余每两组间蜡块着色差异均有统计学意义（P＜0.05），可认为两种酸化方法对活检小标本的预染色无显著差异，水溶性伊红溶液与两种酸化伊红溶液对活检小标本的预染色有显著差异。

图1 醋酸化伊红溶液组胃窦，HE 低倍

图2 盐酸化伊红溶液组胃体，HE 低倍

图3 水溶性伊红溶液组右肺穿刺组织，HE 低倍

2.2 三种伊红染色液使用效果比较 见表1。三种伊红染液使用效果比较，水溶性伊红溶液着色效果不稳定，容易出现脱色现象，该溶液配制简便，用时短且无额外成本；盐酸化伊红溶液着色效果稳定，偶有脱色，该溶液配制过程繁琐，用时较长且成本偏高；醋酸化伊红溶液着色效果稳定，偶有脱色，该溶液配制方法简便，用时较短且成本不高。

表1 不同酸类酸化的伊红溶液使用效果对比

3 讨论

本院内镜活检及穿刺活检组织工作量较大，在固定液中加入伊红，会增加工作量并造成试剂的浪费，所以本科室采用取材时对组织滴染水溶性伊红染液的方法及在脱水机程序的第一缸酒精中滴加伊红的方法来处理该问题。然而在本科室的实际使用情况中发现，在脱水机程序的第一缸酒精中滴加伊红的方法虽然能使包埋滤纸充分着色，但是同样也会造成由于组织与包埋滤纸均着色而导致两者不易区分，进而影响包埋效果的情况出现，更容易造成组织漏包少包的现象。取材时对组织滴染伊红染液也存在滴入量缺乏有效量化的问题,只能根据个人经验滴加，容易造成染色效果的不稳定性[6]，实际运用过程中也往往出现包埋时组织着色不均的情况。

经查阅文献，pH值对于染色至关重要，残留在污渍中的水或试剂即可改变pH值并改变染色特异性[7]。伊红溶液是酸性染液，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞质染色，加入冰醋酸后，可以影响组织中蛋白质的等电点，从而影响蛋白质的电离，促进组织与染料以离子键牢固结合。伊红溶液中加入冰醋酸，起到促染作用，只增强染料的染色能力，不参与染色反应。所以在伊红染液里滴加冰醋酸使伊红溶液的pH值调节是胞质染色的关键[8]。酸化伊红可以促使细胞质着色，在配制染液中，我们加入适量的酸，其目的是为了增强组织细胞的染色力[9]。因此，笔者根据文献配置不同酸类酸化的伊红溶液后滴染活检小标本，并制作组织切片观察染色效果。效果显示，酸化的伊红确实比水溶性伊红着色力强，且不易脱色，也不参与后期试剂反应；但从经济角度、配制方法及使用时间来看，冰醋酸化法较盐酸化法染色液的配制更简便易得，也更实惠。

综上所述，小标本取材时采用冰醋酸化的伊红溶液滴染组织，着色效果好，配制简单，可提高病理标本制作的工作效率，值得推广。