3TC-PA的体外稳定性及大鼠体内药代动力学研究*

罗 萍,唐兰如,王俊俊,陈 勇**,苗潇磊**

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁437100;2.湖北大学中医药生物技术湖北省重点实验室/药物高通量药物筛选技术国家地方联合工程研究中心/生物催化与酶工程国家重点实验室)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的,并且终身携带HBV病毒的慢性肝脏炎症性疾病[1],是导致肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌的主要原因之一[2]。最新数据显示,2021年我国乙肝发病率大幅增长,达到了8%,乙肝新发人数为97.68万人[3]。拉米夫定(lamivudine,3TC)是临床上常用抗HBV药物,安全性良好,但需长期服用,由于长期服用会导致副作用和病毒变异的概率增加,因此,常联合其他抗病毒药物一起使用[4-5]。原儿茶酸(protocatechuic acid,PA)是一种天然酚类化合物,常见于水果、蔬菜、谷物和中草药中[6]。PA具有广泛的药理学活性,如抗炎[7]、抗氧化[8]、保肝[6]、抗病毒[9]等。

由于3TC和PA两者联用在药代动力学上优于单独使用,因此,实验室前期将3TC和PA以酰胺键连接,合成了3TC-PA。本实验研究了3TC-PA的体外稳定性及体内药代动力学特征,期望3TC-PA能够弥补3TC和PA单独使用的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD雄性大鼠6只,SPF级,体重(200±20)g,购自湖北省疾病预防控制中心,合格证号:SCXK(鄂)2020-0018。大鼠饲养于SPF级动物房,室温22℃～25℃,相对湿度45%～65%,12h昼夜交替,自由进食和饮水。

1.1.2 药品与试剂

3TC-PA(实验室合成,纯度≥98%);拉米夫定标准品(纯度≥98%)、原儿茶酸标准品(纯度≥98%)、无水乙酸钠(上海源叶生物科技有限公司);对羟基苯甲醛标准品(ChemFaces公司,纯度≥98%);氢氧化钠、磷酸二氢钾(国药试剂公司,化学纯);乙酸铵(LC-MS级)、冰醋酸(HPLC级)(Sigma Aldrich公司);甲酸(LC-MS级)(Honeywell公司);甲醇(HPLC级)(Fisher公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(赛默飞公司)。

1.1.3 实验设备与仪器

VISION多功能酶标仪(PERKINELMER公司);高效液相色谱仪(LC-20AD,岛津公司);岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪(LCMS-8050,岛津公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 3TC-PA在不同pH水溶液、人工模拟胃、肠液中和大鼠胃、肠内容物的稳定性实验

(1)样品制备与处理:温孵后0,30、60、120、240、360、480、720、1440min取不同pH(1.40、4.00、6.80、6.86、7.80)溶液,0.5、1、2、4、6、8h取大鼠胃、小肠内容物和人工胃液(pH=1.4),2、4、8、12、24h取人工肠液(pH=6.8),4℃、12 000rpm离心10min,取上清检测。

(2)色谱条件:色谱柱:Phenomenex ODS C18柱(150mm×4.6mm,5μm);柱温37℃;流动相A:0.025mol/L醋酸铵溶液(pH=3.8),流动相B:甲醇。梯度洗脱程序:0～5min,5%～35%B;5～6min,35%～70%B;6～8min,70%～50%B;8～8.5min,50%～5%B;8.5～11min,5%B。检测波长:0～4.5min,277nm;4.5～6.5min,260nm;6.5～11min,277nm。流速:1mL/min;进样量:10μL。

(3)方法学考察:①专属性:检测空白pH溶液,人工模拟胃、肠液,加入3TC-PA的空白pH溶液和人工模拟胃肠液以及3TC-PA在不同pH溶液和人工模拟胃肠液中温孵后的样品。②线性及范围:配制不同浓度的3TC-PA溶液进行检测;以峰面积和浓度计算回归方程。③精密度和准确度:配制低、中、高浓度的3TC-PA质量控制(quality controls,QC)样品进行检测,计算准确度(RE)和精密度(RSD)。

1.2.2 3TC-PA在大鼠肝匀浆中的稳定性实验

(1)样品制备和处理:取不同时间点(0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h)的3TC-PA肝匀浆温孵溶液100μL,加入300μL甲醇,涡旋振荡10min,4℃、12 000rpm离心10min,取上层有机相200μL,挥干,加入100μL流动相复溶,再次离心,取上清检测。

(2)色谱条件:色谱柱、柱温、流动相、流速、进样量同1.2.1(2)。梯度洗脱:0～6min,10%～15%B;6～7min,15%～40%B;7～11min,40%B;11～12min,40%～10%B;12～15min,10%B。检测波长:0～5min,277nm;5～6.5min,260nm;6.5～15min,277nm。

(3)方法学考察:①专属性:检测空白肝匀浆、加入3TC-PA的空白肝匀浆以及在肝匀浆中温孵后的样品。②线性及范围:配制不同浓度的3TC-PA对照品溶液,分别取10μL加到空白肝匀浆中,配置不同浓度的校正标样进行检测;以峰面积和浓度计算回归方程。③精密度和准确度:分别配制低、中、高浓度的3TC-PAQC样品,计算RE和RSD。

1.2.3 3TC-PA在大鼠全血中的体外稳定性

(1)样品制备和处理:采集大鼠腹主动脉血,取不同时间点[同1.2.2(1)]的3TC-PA全血温孵溶液100μL,按1.2.2(1)的方法进行处理后取上清检测。

(2)色谱条件:色谱柱、柱温37℃、流动相、流速、进样量同1.2.1(2)。梯度洗脱:0～5min,20%～50%B;5～6min,50%B;6～8min,50%～20%B;8～11min,20%B。检测波长:0～3min 277nm,3～5min 260nm,5～11min 277nm。

(3)方法学考察:方法同1.2.2(3)。

1.2.4 3TC-PA大鼠体内药代动力学

(1)样品制备和处理:大鼠单次灌胃3TC-PA(15.26mg/kg)溶液后,于5、10、15、30、45、60、90、120、240、360min取血检测。

(2)色谱条件:色谱柱:Shim-pack VP-ODS柱(150×2.0mm)。柱温40℃;流动相A:0.05%甲酸;流动相B:甲醇。等度洗脱:32%B;流速0.2mL/min;进样量10μL。

(3)质谱条件:采用ESI源,负离子MRM模式检测。

(4)方法学考察:①专属性:分别检测空白大鼠血浆、加入3TC-PA和内标的空白血浆以及加入内标的3TC-PA大鼠血浆样品。②线性及范围:配制不同浓度血浆校正标样进行检测;以峰面积和浓度计算回归方程。③精密度和准确度:配制血浆质控样品进行检测,计算RSD和RE。④基质效应和提取回收率:检测样品A(3TC-PA的质控工作液和内标混合液)、样品B(空白血浆)、样品C(含3TC-PA质控工作液、内标的空白血浆),计算基质效应和提取回收率。⑤稳定性:检测LQC和HQC的3TC-PA在大鼠血浆中的样品,室温放置2h,-80℃冻融2次,进样盘4℃放置24h后分析。

1.2.5 3TC-PA大鼠肝、肾组织的分布

大鼠灌胃3TC-PA溶液后,于6、15、240min收集肝脏和肾脏,制成匀浆。方法同1.2.4(4)。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 3TC-PA在不同pH溶液和人工模拟胃、肠液中的稳定性

2.1.1 方法学结果

如图1所示,3TC-PA的专属性良好,介质中无明显干扰峰,3TC-PA保留时间为7.8min。3TC-PA的线性回归方程为Y=6755.3X+2143.1,R2=0.9999。结果表明,3TC-PA在1～32μg/mL的范围内呈良好的线性关系。3TC-PA低、中、高浓度QC样品的RE和RSD如表1所示。RSD和RE良好,符合定量分析要求。

表1 人工胃液中3TC-PA的RSD和RE(n=6)

A:空白人工胃液;B:3TC-PA在人工胃液中校正标样;C:3TC-PA在人工胃液中温孵4h后

2.1.2 3TC-PA在不同pH溶液中稳定性

如图2所示,3TC-PA在pH=1.4的环境下8h内未见分解,12～24h相较于温孵前含量下降了30%,在纯水及其他pH缓冲介质中比较稳定,未见明显分解(降解率<10%)。

A:纯水(pH=6.80);B:pH=4.00;C:pH=1.40;D:pH=6.86;E:pH=7.80

2.1.3 3TC-PA在人工模拟胃肠液中稳定性

如图3所示,3TC-PA在胃内容物中温孵4h内未见明显分解(降解率<10%),6～8h有少量分解(10%～16%),在人工胃液、人工肠液、肠内容物中无明显分解(降解率<10%),较为稳定。

A:人工胃液;B:人工肠液;C:胃内容物;D:肠内容物

2.2 3TC-PA在大鼠肝匀浆中的体外稳定性

2.2.1 方法学结果

由图4可知,介质对3TC-PA的检测无干扰,表明该方法具有良好的专属性,3TC-PA保留时间为11.1min。3TC-PA在大鼠肝匀浆中的标准曲线回归方程为Y=607.78X-20685,R2=0.9945。结果表明,3TC-PA在100～260μg/mL范围内呈良好的线性关系。3TC-PA低、中、高浓度QC样品的RE和RSD如见表2。RSD值均小于15%,准确度85%～115%,满足定量分析要求。

表2 大鼠肝匀浆中3TC-PA的RSD和RE(n=6)

A:空白肝匀浆;B:3TC-PA在肝匀浆中校正标样;C:3TC-PA在肝匀浆中温孵1h后

2.2.2 3TC-PA在大鼠肝匀浆中的稳定性

如图5所示,3TC-PA在大鼠肝匀浆中6h内未见明显分解(降解率<10%),6～24h有少量分解(降解率<20%)。

2.3 3TC-PA在大鼠全血中的体外稳定性

2.3.1 方法学结果

由图6可知,介质对3TC-PA的检测无干扰,表明该方法具有良好的专属性,3TC-PA的保留时间为6.3min。3TC-PA在大鼠全血中的标准曲线回归方程为Y=242.66X-37053,R2=0.9992。结果表明,3TC-PA在100～300μg/mL范围内呈良好的线性关系。低、中、高浓度的3TC-PAQC样品的RE和RSD见表3。RSD均小于15%,RE在85%～115%,满足定量分析要求。

表3 大鼠全血中3TC-PA的RSD和

A:空白全血;B:3TC-PA在全血中校正标样;C:3TC-PA在全血中温孵8h后

2.3.2 3TC-PA在大鼠全血中的稳定性

如图7所示,3TC-PA在大鼠全血中24h含量几乎不变,表明3TC-PA在大鼠全血中较为稳定。

图7 3TC-PA在大鼠全血中的剩余百分率

2.4 3TC-PA在大鼠体内的药代动力学特征

2.4.1 方法学结果

由图8可知,3TC出峰时间为8.3min,内标AD出峰时间为5.3min,血浆中内源性物质不干扰内标及3TC-PA的检测,该方法专属性良好。图9显示3TC-PA和内标AD在系统中无明显残留现象。3TC-PA在大鼠血浆中的标准曲线:Y=0.0501930X+0.0368356(R2=0.992),线性范围:2～256ng/mL,在此范围内线性良好,其中8个浓度点校正标样的准确度均在85%～115%。如表4和表5所示,该方法下3TC-PA的批内批间精密度RSD小于15%,RE在±15%之间,基质效应和提取回收率结果的RSD≤15%,表明该方法符合定量分析要求。3TC-PA在大鼠血浆中稳定性考察结果如表6所示,测得浓度与标示浓度的偏差在±15%以内,说明含3TC-PA大鼠血浆样品稳定性良好。

表4 3TC-PA在大鼠血浆中的RSD和RE(n=6)

表5 3TC-PA在大鼠血浆中的基质效应和提取回收率(n=6)

表6 3TC-PA在大鼠血浆中的稳定性(n=6)

A:空白大鼠血浆;B:大鼠灌胃3TC-PA 30min后的血浆样品;C:含3TC-PA(2ng/mL)及内标(100ng/mL)的血浆校正标样

图9 3TC-PA和内标在大鼠血浆中进样残留的TIC色谱图

2.4.2 血浆药动学结果

血药浓度-时间曲线如图10所示,3TC-PA药代动力学参数见表7。3TC-PA的消除半衰期t1/2z为(68.12 ±53.37)min,Tmax约为15min,表明3TC-PA在大鼠体内能够被迅速吸收。

表7 大鼠单次灌胃3TC-PA后平均药代动力学参数(n=6)

图10 大鼠单次灌胃3TC-PA后平均血药浓度随时间变化曲线(n=6)

2.5 3TC-PA在大鼠肝、肾组织中的含量

2.5.1 方法学结果

如图11和图12所示,肝匀浆/肾匀浆中内源性物质低于内标响应值的5%,且不干扰内标及3TC-PA的检测,方法专属性良好。图13显示3TC-PA和内标AD在系统中无明显残留现象。3TC-PA在大鼠肝匀浆和肾匀浆中的标准曲线分别为:Y=0.024X+0.095(R2=0.992),Y=0.009X+0.017(R2=0.999),线性范围:2～256ng/mL,在此范围内线性良好,其中8个浓度点校正标样的准确度均在85%～115%。如表8和表9所示,3TC-PA的批内批间精密度RSD均小于15%,RE均在±15%之间,基质效应和提取回收率结果的RSD≤15%,表明该方法符合定量分析要求。3TC-PA在大鼠肝匀浆/肾匀浆中稳定性考察结果如表10所示,测得浓度与标示浓度的偏差在±15%以内,说明含3TC-PA大鼠肝匀浆/肾匀浆样品稳定性良好。

表8 3TC-PA在大鼠肝、肾组织匀浆中的RSD和RE(n=6)

表9 3TC-PA在大鼠肝、肾组织匀浆中的基质效应和提取回收率(n=6)

表10 3TC-PA在大鼠肝、肾组织匀浆中的稳定性(n=6)

A:空白大鼠肝匀浆样品;B:含3TC-PA(2ng/mL)和内标(100ng/mL)的肝匀浆校正标样;C:大鼠灌胃3TC-PA(15.26mg/kg)15min后肝组织的匀浆样品

A:空白大鼠肾匀浆样品;B:含3TC-PA(2ng/mL)和内标(100ng/mL)的肾匀浆校正标样;C:大鼠灌胃3TC-PA(15.26mg/kg)15min后肾组织的匀浆样品

A:空白肝匀浆;B:空白肾匀浆

2.5.2 3TC-PA肝、肾组织含量

如图14所示,大鼠灌胃3TC-PA后,6min时3TC-PA在肝组织中含量为(31.96±16.30)ng/g,肾组织中含量为(4.77±3.83)ng/g;15min时肝组织中含量为(50.65±16.10)ng/g,肾组织中含量为(17.33±9.03)ng/g;240 min时肝组织中含量为(20.00±11.46)ng/g,肾组织中含量为(7.00±6.60)ng/g。在血浆中达峰时间15min,肝脏和肾脏组织中浓度最高,且各时间点3TC-PA在肝脏中比肾脏中暴露量更高。

图14 大鼠单次灌胃3TC-PA肝、肾组织中的含量(n=6)

3 讨 论

3TC和PA联合抗HBV具有更好的药效和药代动力学性质,并且可以改善3TC的停药反跳和长期用药的耐药性问题,本实验室前期将3TC和PA以酰胺键连接,合成了化合物3TC-PA。3TC-PA进入体内后可能被水解为3TC和PA以前药的形式发挥作用,同时也可能具有良好的稳定性以原药的形式发挥作用。由于食物在胃、小肠、大肠内停留的时间分别为4～6、6～8、18～24h,所以我们考察了3TC-PA在胃内容物、小肠内容物、人工胃液8h内、人工肠液24h内的稳定性,这样可以最大程度地模拟药物在胃肠道内的停留情况。本研究发现3TC-PA在中性和碱性条件下能够稳定存在,酸性pH条件(pH=1.4)8h开始分解,人体液环境为弱碱性,胃内属于强酸环境,口服给药,药物在胃内停留时间内3TC-PA几乎无分解,提示3TC-PA不易被化学和酶水解,大部分可以以原形入肠吸收;8h之内,3TC-PA可以稳定的存在于肠环境中;在血液中也可稳定存在,在肝匀浆中仅在6h之后有少量分解。体外稳定性实验结果提示3TC-PA在以上介质中稳定性良好。

3TC治疗HBV临床给药剂量是100mg/d,根据人和大鼠体表面积折算,换算出大鼠3TC-PA的给药剂量为15.26mg/kg。我们建立了HPLC-MS/MS方法对3TC-PA在血浆和肝、肾组织匀浆中的含量进行定量分析,并对该分析方法进行验证,结果表明该方法专属性、线性、RSD和RE、基质效应和提取回收率、稳定性良好,可以满足度对生物样本中3TC-PA的定量分析检测。对3TC-PA灌胃给药后血浆、肝肾组织匀浆样品色谱图进行分析,未见3TC和PA色谱峰的出现。因为肝脏是抗乙肝病毒药物的作用器官,同时参与体内多种代谢和生理过程,肾脏排泄关系到药物的安全性与有效性,且3TC主要是经肾脏消除,因此,我们选择肝和肾进行了3TC-PA的组织分布研究。药动学及肝、肾组织含量测定结果提示3TC-PA在大鼠体内吸收、消除迅速,且能快速分布至肝脏和肾脏,肝组织中3TC-PA的含量高于肾组织。

综上所述,3TC-PA具有良好的稳定性,本研究为3TC-PA成为抗HBV候选化合物提供了实验基础,为抗HBV药物的开发提供了新的思路。