绝经后骨质疏松患者血清SIK2，SMURF1表达水平及其与骨代谢、骨密度指标的相关性研究

高艳超，王 岩，柳 越，孙永艳（朝阳市第二医院内分泌科，辽宁朝阳 122000）

骨质疏松症（osteoporosis）是一种代谢性骨病，多种因素造成患者骨量丢失，骨密度、强度降低，骨结构破坏，增加患者骨折风险[1]。引起骨质疏松的原因较多，其中与中老年妇女绝经有关的骨质疏松症称为绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)。我国目前骨质疏松症病例超过7 千万例，其中50 岁以上女性患者约占20.7%[2]。研究认为绝经时雌性激素的丢失和卵巢功能衰退是引起骨质加速流失的影响因素，绝经后骨质疏松患病率约为未绝经的2～3 倍[3]。盐诱导激酶（salt-inducible kinase，SIK）是一种AMPK 家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在能量、细胞代谢中发挥重要作用[4]。SIK2 被证实能够参与调控细胞自噬体成熟及自噬过程[5]。Smad 泛素化调节因子1(smad ubiquitination regulator 1,SMURF1)是泛素连接酶Hect 家族新成员，可诱导Smad1，Smad5 泛素化及降解，与骨质疏松症患者发生发展及骨代谢关系密切[6]。基于此本研究通过分析绝经后骨质疏松患者血清SIK2 和SMURF1 表达水平，探讨其与患者骨代谢、骨密度的关系，以期揭示可能的作用机制，为临床研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取朝阳市第二医院2019 年4月～2021 年4 月收治的154 例绝经后骨质疏松患者作为研究组，年龄50～68（59.76±7.21）岁，绝经时间3～8（5.24±1.20）年，体质量指数（BMI）20.67～25.76（23.82±1.80）kg/m2； 基础疾病：高血压史24 例，糖尿病史46 例。另选取同时期在我院体检的150 例绝经后健康女性作为对照组，年龄50～69（59.83±7.17）岁，绝经时间3～8（5.14±1.30）年；BMI 20.87～25.79（23.62±1.78）kg/m2；基础疾病：高血压史31 例，糖尿病史38 例。两组年龄（t=0.086，P=0.932）、绝经时间（t=0.697，P=0.486）、BMI（t=0.974，P=0.331）、高血压史（χ2=1.324，P=0.250）、糖尿病史（χ2=0.782，P=0.376）比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：①患者符合骨质疏松诊断标准：双能X 射线骨密度仪测定骨密度T 值≤-2.5；②自然绝经一年以上女性，骨质疏松患病原因与雌性激素水平波动有关。③年龄范围50～70 岁；④未接受过影响骨代谢药物治疗；⑤患者自愿签署研究知情同意书。排除标准：①绝经前患有骨质疏松症；②内分泌紊乱相关疾病引发的继发性骨质疏松；③入组半年内使用过影响骨代谢药物；④并发其他骨疾病；⑤并发免疫系统、血液系统疾病；⑥并发严重脏器功能障碍及感染性疾病；⑦患者临床资料缺失及不能自主配合研究者。本研究已通过医院伦理委员会审核批准。

1.2 仪器与试剂 本研究主要仪器有QuantStudioTM3实时荧光定量PCR 仪（北京宏达恒业科技有限公司），双能X 射线骨密度检测仪（徐州品源电子科技有限公司，BMD-A5），全自动化学发光免疫分析仪（上海智岩科学仪器有限公司，AUTOAE2100）。主要试剂有总RNA 提取剂（Trizol）、骨钙素试剂盒、Ⅰ型胶原氨基端前肽试剂盒、β-胶原降解产物试剂盒、甲状旁腺素试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；鼠抗人SIK2 单克隆抗体、鼠抗人SMURF1 单克隆抗体（上海群己生物科技有限公司）；骨桥蛋白试剂盒、25-OH-D 试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）。

1.3 方法 抽取受检者清晨空腹肘部静脉血3 ml，3 000 r/min 离心10 min 后吸取上清液，置于-20℃保存待测。取血清样本以qRT-PCR 法检测血清SIK2 和SMURF1 表达水平，使用Trizol 提取血清总RNA，逆转录得到cDNA，进行PCR 扩增，以GAPDH 作内参。SIK2 上游引物：5’-TCCTGCTTCCTGTCAC TAT-3’，下游引物：5’-TCCACGGCTTCTACCATT-3’；SMURF1 上游引物：5’-ATCCCTGGTACAGC GACTCCGAAATCCT-3’，下游引物：5’-GTCCCTGC ACTGTTGTCCTTTGCTCATA-3’；GAPDH 上游引物：5’-TGGTGCTGAGTATGTCGTGG-3’，下游引物：5’-GGTTCACACCCATCACAAAC-3’。反应条件：95℃90 s（预变性）；95℃60 s（变性），60℃30 s（退火），75℃30 s（延伸），共进行40 个循环。SIK2，SMURF1 相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。以电化学发光法检测骨钙素（osteocalcin，OC）、25 羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OHD）、Ⅰ型胶原氨基端前肽（N-terminal propeptide of type Ⅰ procollagen，PINP）、β- 胶原降解产物（bate C-terminal cross-linked telopeptids of typeⅠ collagen，β-CTx）、甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）水平，具体操作严格按照操作说明进行。通过双能X 射线骨密度仪对两组研究对象的股骨颈、腰椎L1～4 进行骨密度测定。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件进行数据处理，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验分析两组间计数资料；计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验分析两组间计量资料；用Pearson 相关法分析血清SIK2，SMURF1 表达水平与骨代谢指标、骨密度的相关性；Logistic 回归分析绝经后骨质疏松的影响因素；受试者工作特征（ROC）曲线分析血清SIK2，SMURF1 对绝经后骨质疏松的预测价值。α=0.05 为检验水准。

2 结果

2.1 两组血清SIK2，SMURF1，骨代谢指标、骨密度水平比较 见表1。与对照组相比，研究组血清25-OH-D 水平以及腰椎L1～4、股骨颈骨密度水平均显著降低，血清OPN，PTH，SIK2，β-CTX，OC，PINP 及SMURF1 表达水平显著升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组血清SIK2，SMURF1，骨代谢指标、骨密度水平比较（±s）

表1 两组血清SIK2，SMURF1，骨代谢指标、骨密度水平比较（±s）

项 目对照组（n=150）研究组（n=154）t 值P 值SIK20.79±0.170.94±0.167.9240.000 SMURF10.66±0.160.93±0.2211.7590.000骨代谢指标PINP（ng/ml）36.47±4.6241.28±4.689.0160.000 OPN（ng/ml）16.78±2.6918.67±3.175.5980.000 β-CTx（pg/ml）4.28±0.845.12±0.968.1110.000 OC（ng/ml）13.28±2.1415.64±2.738.3740.000 25-OH-D（ng/ml）14.31±2.6212.07±2.767.2540.000 PTH（pg/ml）64.31±8.2471.26±8.887.0690.000骨密度（g/cm3） 腰椎L1～40.86±0.210.71±0.206.3780.000股骨颈0.82±0.190.61±0.189.8950.000

2.2 血清SIK2，SMURF1 表达水平与骨代谢指标、骨密度的相关性 见表2。血清SIK2 与OPN，OC，SMURF1，β-CTx，PINP 呈正相关（均P＜0.05），SMURF1 与β-CTx，PINP，OPN，PTH，OC 呈 正相关（均P＜0.05）；血清SIK2，SMURF1 与25-OHD，股骨颈骨密度均呈明显负相关（均P＜0.05）。

表2 血清SIK2，SMURF1 表达水平与骨代谢指标、骨密度的相关性

2.3 Logistic 回归分析绝经后骨质疏松的影响因素见表3。以绝经后是否发生骨质疏松（赋值：绝经后健康=0，绝经后骨质疏松=1）作为因变量，将上述检测指标（均为连续变量）作为自变量，进行Logistic 回归分析。结果显示，SIK2，SMURF1，PINP，OPN，OC 和股骨颈骨密度是绝经后骨质疏松症发生的影响因素（均P＜0.05）。

表3 Logistic 回归分析绝经后骨质疏松的影响因素

2.4 血清SIK2，SMURF1 对绝经后骨质疏松的预测价值 见表4 和图1。ROC 曲线分析结果显示，二者联合预测的AUC 显著大于SIK2 单独预测的AUC（Z=3.339，P＜0.001），与SMURF1 单独预测的AUC 差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 血清SIK2，SMURF1 预测绝经后骨质疏松的ROC 曲线

表4 血清SIK2，SMURF1 对绝经后骨质疏松的预测价值

3 讨论

绝经后骨质疏松症与年龄相关，女性绝经后卵巢功能减退、雌激素缺失是骨质疏松的发病因素，导致患者破骨细胞活性增加，破坏骨结构[7]。绝经后骨质疏松患者主要临床症状表现为卧位痛、翻身痛、起坐痛及行走痛，并常伴有局部压痛或叩击痛，易发生骨骼畸形和骨折[8]，对患者生活造成极大负担。现有研究认为，雌激素缺乏、氧化应激等因素是引发绝经后骨质疏松的影响因素[9]，但其发病机制仍不清晰。因此，本研究探讨绝经后骨质疏松患者血清SIK2，SMURF1 与骨代谢指标、骨密度的相关性，以期为临床诊断和预防绝经后骨质疏松提供技术参考。

SIK2是AMPK磷酸激活蛋白酶家族中的成员。研究认为SIK2 表达升高与细胞自噬体成熟及自噬反应有关[10]，SIK2 表达下调可抑制细胞异常自噬，减轻细胞损伤程度。巨噬细胞活性与机体炎症反应程度及机体免疫相关，绝经后骨质疏松患者炎症因子水平升高，激活巨噬细胞极化，介导促炎因子大量释放，加重炎症反应程度，引起组织损伤，破骨细胞活性、骨吸收增强，使机体免疫能力下降[11]。经炎症因子激活后的巨噬细胞能够促进SIK2产生，提高其表达水平。本研究结果显示，绝经后骨质疏松患者血清SIK2 表达水平升高。绝经后骨质疏松患者SIK2 水平升高可能与巨噬细胞活性增强、机体免疫能力降低、骨髓间充质干细胞（BMSCs）衰老、成骨细胞分化受限、骨量丢失有关[12]。也有研究表示，自噬水平低促进损伤，骨质疏松患者BMSCs 的自噬水平低于正常健康细胞，抑制患者成骨分化能力[13]。SMURF1是泛素连接酶家族成员，通过泛素化降解骨形态发生蛋白（BMP），高水平SMURF1 抑制BMP 信号传导，抑制BMSCs 的成骨分化，降低骨强度，促进骨量丢失和骨矿化，引起骨质疏松下调SMURF1 水平促进BMP 释放，加速成骨细胞分化，减少细胞凋亡[14]。

绝经后女性雌激素水平降低是骨质疏松发生的影响因素，给予绝经后骨质疏松患者激素治疗，明显改善患者症状[15]。SIK2 与卵巢正常功能和生育能力关系密切，敲除SIK2 基因促进性腺激素诱导卵巢细胞分化，产生雌二醇，使促卵泡激素（FSH）水平极大程度提升[16]。SMURF1 是泛素酶家族成员，参与调控机体多种代谢通路。研究认为SMURF1 参与调控骨代谢过程中重要的信号转导过程，动物实验进一步表明降低小鼠体内雌激素水平，抑制骨吸收，增强破骨细胞活性，致使转化生长因子β（TGF-β）/Smad 信号通路异常，引起机体SMURF1 水平升高，最终导致骨质疏松[17]。本研究结果显示，SIK2，SMURF1 表达水平升高与绝经后骨质疏松发生关系密切，高水平SIK2 诱导卵巢雌激素分泌异常，激活机体巨噬细胞活性，促进炎性介质释放，造成异常自噬引起患者成骨细胞与破骨细胞间平衡紊乱，骨内稳态破坏，致使SMURF1水平升高，进一步破坏骨结构稳态，增强破骨细胞活性，损伤机体组织，降低免疫抵抗力[18]，最终导致骨质疏松。

骨代谢指标水平异常影响绝经后骨质疏松发生，研究结果显示，绝经后骨质疏松患者血清PINP，β-CTx，OPN 及PTH 水平升高，25-OH-D水平降低，SIK2，SMURF1 与PINP，OPN，β-CTX，OC，PTH 呈正相关，与25-OH-D，股骨颈骨密度呈负相关。PINP 水平变化能够一定程度反映骨代谢水平[19]，绝经后雌激素水平降低，骨形成量低于骨吸收量，使PINP 水平升高。β-CTx 水平与破骨细胞活性相关，其水平随患者骨吸收加强而升高[20]，破骨细胞活性增加，激活巨噬细胞促进促炎因子释放，引发炎症反应使得机体免疫功能降低，加剧组织损伤。OC 是影响骨周转率的指标，绝经后骨质疏松属于高转化型导致OC 水平升高[21]。血清25-OH-D 是骨代谢调节的重要因素，反映人体钙水平，骨质疏松患者维生素D 水平低，骨钙含量低，脆性增加提高骨折发生风险[22]。PTH参与调节血钙，一定程度增强破骨细胞活性，刺激成骨细胞作用[23]。本研究发现，绝经后骨质疏松症患者股骨颈、腰椎L1～4 骨密度明显降低，绝经后女性雌激素水平降低，卵巢功能衰减影响骨代谢活动，降低骨密度。本研究证实了血清中高水平SIK2，SMURF1 是绝经后骨质疏松的影响因素，二者联合预测绝经后骨质疏松具有较好效能。高水平SIK2 介导机体异常自噬，诱导促炎因子释放，激活巨噬细胞活性，加重炎症反应程度，促进组织损伤。SMURF1 水平升高负调控BMP 因子释放，减弱成骨细胞分化及骨代谢，促进骨量丢失，导致骨质疏松。临床可将血清SIK2，SMURF1 指标应用于预测绝经后骨质疏松发生，并可通过特异治疗调控二者表达水平，为临床治疗绝经后骨质疏松提供指导方向。综上所述，绝经后骨质疏松患者血清SIK2，SMURF1 异常过表达，且与PINP，OPN，β-CTx，OC 和PTH 呈正相关，与25-OH-D 和股骨颈骨密度呈负相关。然而本研究仅从宏观角度出发探讨以上指标的相关性，研究切入点不够深刻，还需进一步研究SIK2，SMURF1 与绝经后骨质疏松间的作用机制及其与患者预后的关系。