电感耦合等离子体质谱法分析不同产地使君子中无机元素及健康风险评估

代磊,邹佳佳,徐小力,何丹

(重庆医科大学药学院,重庆 400016)

使君子(QuisqualisFructus)为使君子科植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥成熟果实,具有杀虫消积、健脾止泻的功效,常用于治疗蛔虫病、蛲虫病、小儿积疳等[1]。使君子中含有葫芦巴碱、鞣花酸、没食子酸等多种活性成分,现代研究发现还具有抗炎、抗氧化、改善前列腺增生等药理作用[2-5]。历代本草记载,其宋代以前道地产区为现在两广一带,后逐渐由两广变迁到福建与四川[6]。第四次中药资源普查显示,使君子为重庆大宗道地药材,且铜梁使君子已被评为国家地理标志保护产品[7]。道地药材产地变迁往往存在品质差异,评价产地变迁的合理性常以药材的质量为标准,而分析中药材中无机元素常用于产地溯源及质量评价[8-9]。此外,无机元素的摄入量常常与疾病紧密相关,钠(Na)、镁(Mg)、钾(K)、钙(Ca)等常量元素是人体的重要组成部分,铁(Fe)、锰(Mn)、硒(Se)等微量元素在人体的许多生理过程中发挥着重要作用,包括细胞代谢、免疫反应和基因表达等[10-12],而汞(Hg)、铜(Cu)、砷(As)、镉(Cd)、铅(Pb)等重金属有害元素容易在肝、肾、脾等器官中积累而导致不同程度的人体损害[13]。《中国居民膳食营养素参考摄入量》规定了Na、Mg、K、Ca等人体必需常量元素及Fe、锌(Zn)、Se、Cu、钴(Co)等人体必需微量元素的参考摄入量[14],《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)(2020年版)已对人参、当归、金银花等28种药材及饮片中Pb、Cd、As、Hg、Cu重金属有害元素做了限量要求[15]。

相比于传统的原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrometry,AAS),电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)具有检出限低、质谱干扰少、多元素同时测定等优势,《中国药典》(2020年版)、USP-NF 2022、EP 11.0及相关文献均推荐采用ICP-MS进行中药无机元素谱及有害元素安全性研究[16-17]。本实验采用ICP-MS测定了24个不同产地使君子中25种无机元素,比较各产地使君子中无机元素差异,并评估有害元素的健康风险,为使君子的无机元素含量研究及质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 RRH-A500高速多功能粉碎机(上海缘沃工贸有限公司);321LS电子天平[天美仪拓实验室设备(上海)有限公司,感量:0.1 mg];DKQ-1800智能控温电加热器(上海屹尧科技发展有限公司);WX-6000微波消解仪(上海屹尧科技发展有限公司);Milli-Q型纯水仪(美国Millipore公司);Agilent 7800 ICP-MS(安捷伦科技有限公司)。

1.2药品与试剂 多元素混合标准溶液(10 μg·mL-1,含Na、Mg、铝(Al)、K、Ca、钒(V)、Mn、Fe、Co、镍(Ni)、Cu、Zn、镓(Ga)、As、Se、铷(Rb)、锶(Sr)、银(Ag)、Cd、铯(Cs)、钡(Ba)、铊(TI)、Pb、铀(U)等24种元素,批号:51-240CRY2);Hg标准溶液(10 μg·mL-1,批号:12-142HGY2);Au标准溶液(1000 μg·mL-1,批号:B21080309);混合内标溶液(10 μg·mL-1,含Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Bi等7种元素,批号:55-209CRY2)均购自美国Agilent公司;硝酸[MOS级,69.0%～70.0%,重庆川东化工(集团)有限公司];使君子药材购买于各产地中药市场及零售店,保存在重庆医科大学药学院创新药物辅料中心阴凉干燥处,共24批如表1所示,样品经重庆医科大学中医药学院王坚副教授鉴定为使君子科植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥成熟果实。

2 方法和结果

2.1ICP-MS测定条件 射频功率1 550 W;等离子气体积流量15 L·min-1;辅助气体积流量1.0 L·min-1;雾化气体积流量1.0 L·min-1;雾化室温2.0 ℃;测量模式为碰撞池模式(KED);碰撞气体积流量4.0 mL·min-1;泵速0.3 rps,重复测定3次,分析模式全定量分析。“He”模式下选用Sc作为内标,测定Na、Mg、Al、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Zn;Ge作为内标,测定Cu、Ga、As、Rb、Se、Sr;In作为内标,测定Ag、Cd、Cs、Ba;Bi作为内标,测定Hg、TI、Pb、U。

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液的制备 精密量取多元素混合标准溶液(10 μg·mL-1)适量,用5%硝酸梯度稀释成含Na、Mg、Al、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、TI、Pb、U质量浓度分别为1,5,10,20,50,100,200,500,1 000,3 000 ng·mL-1的系列混合标准溶液;精密量取Hg标准溶液(10 μg·mL-1)适量,用5%硝酸梯度稀释成含Hg质量浓度分别为0.1,0.2,0.5,1,2,5 ng·mL-1的标准溶液;精密量取Au标准溶液(1 000 μg·mL-1)适量,5%硝酸稀释成含Au质量浓度为1 μg·mL-1的储备液。

2.2.2内标溶液的制备 精密吸取混合内标溶液适量,用5%硝酸稀释制成浓度为200 ng·mL-1的内标溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 将使君子药材粉碎,过孔径约0.180 mm(80目筛),精密称取粉末0.5 g,置聚四氟乙烯微波消解罐中,加入浓硝酸8 mL,在石墨电热板上120 ℃预消解40 min,密封,按表2微波消解条件消解。冷却,取出消解罐,置石墨电热板上赶酸40 min至溶液约1 mL,移取溶液至25 mL量瓶,用2%硝酸清洗消解罐3次,合并洗液至量瓶,加入Au储备液0.1 mL并定容至刻度,0.22 μm水系滤膜过滤得供试品溶液Ⅰ,用于测定Na、V、Co、Ni、Cu、Ga、As、Rb、Se、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Hg、TI、Pb、U元素;精密量取供试品溶液Ⅰ0.2 mL至25 mL容量瓶,2%硝酸定容得供试品溶液 Ⅱ,用于测定Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Zn元素。依据同法制备空白溶液。

表2 微波消解条件

2.3方法学验证

2.3.1线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品线性系列溶液,按“2.1”项下条件进行测定,以各元素与内标元素响应值的比值为纵坐标(Y),元素质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,根据标曲计算各元素相应的浓度,同时扣除空白溶液的干扰,进行线性回归,求得回归方程见表3。结果表明25种元素在各自线性范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999 4。

表3 25种无机元素线性、检出限和定量限

2.3.2检出限和定量限 按 “2.1”项下条件对同法制备的空白溶液重复测定11次,以各元素信号响应值3倍标准偏差(δ)除以其标准曲线斜率k所对应的质量浓度作为检测限(LOD),10倍为定量限(LOQ),如表3所示。

2.3.3仪器精密度实验 按 “2.1”项下条件,对“2.2.1”项下制备的200 μg·L-1标准品溶液重复测定6次,以各元素响应值计算RSD,结果各元素响应值RSD为0.10%～3.00%,如表4所示,表明仪器精密度良好。

2.3.4溶液稳定性实验 选取同一供试品溶液(S1),按 “2.1”项下条件测定,分别于0、2、4、8、12 h进样分析。各元素响应值的RSD为0.67%～5.55%,如表4所示,表明各元素在12 h内测定结果稳定。

2.3.5重复性实验 精密称取使君子药材粉末(S1)0.5 g,共6份,按 “2.2.3”项下制备供试品溶液,按 “2.1”项下条件测定,各元素响应值RSD为1.73%～7.85%,如表4所示,表明方法重复性良好。

2.3.6加样回收率实验 精密称取使君子药材粉末(S1)0.5 g,精密加入低、中、高梯度混合标准溶液适量使供试品溶液Ⅰ含有10、100、10 000 ng·mL-1的混合标准溶液,每个梯度平行测定6份,按 “2.2.3”项下制备供试品溶液,按 “2.1”项下条件测定,根据样本含量选择与梯度浓度较为接近的各元素加标量,计算加样回收率,各元素加样回收率在85.49%～116.84%,RSD为0.44%～8.71%,如表4所示,表明该方法准确可靠。

2.3.7各元素含量测定 取24个不同产地使君子药材(S1～S24),按 “2.2.3”项下制备供试品溶液,按 “2.1”项下条件测定,采用内标法将各元素响应值与内标响应值的比值代入标准曲线进行计算,结果见表5。结果发现常量元素中K含量最高,平均含量1.726 9×104mg·kg-1,微量元素中Fe含量最高,平均含量1.098 2×102mg·kg-1,重金属及有害元素中Cu含量最高,平均含量16.041 1 mg·kg-1。各产地Mg、K、Ca、Cu、Sr元素差异较小,RSD均低于20%,常量元素Na、有害元素As、Pb不同产地间差异较大,RSD均大于50%,Na、As在S4样本(重庆长寿)中含量最高,分别为42.628 9 mg·kg-1和0.167 1 mg·kg-1,Pb在S1样本(重庆合川)中含量最高,为1.614 0 mg·kg-1。Ag、Hg、TI、U元素含量较低,仅少数样本中测出轻微含量,说明Ag、Hg、TI、U非使君子必需元素,可能与种植的自然环境有关,也可能由于采摘、炮制、运输时外部污染所致。

表5 25种无机元素含量测定结果

2.4指纹图谱分析 以25种元素为横坐标,元素的质量浓度为纵坐标,同时将K缩小至1%,Mg、Al、Ca、Fe缩小至10%,Co、As、Cd、Pb扩大至1%至同一数量级后绘制使君子无机元素指纹图谱,结果见图1。由图可知,不同产地使君子具有相似的无机元素含量变化趋势,其中常量元素Mg、Al、K、Ca差异较小而较为稳定,微量元素Cu、Zn、As、Cd、Pb受多方面影响而略有差异。各产地使君子栽培的土壤环境、采摘季节、地理气候各不相同,但生成的无机元素谱具有一定的规律性和相似性,可用于鉴别使君子中无机元素特征。

图1 使君子无机元素指纹图谱

2.5化学计量学分析

2.5.1聚类热图分析 采用TBtools版软件对24个产地的25种元素进行聚类热图分析,如图2所示。其中产地聚类可大致分为重庆使君子和四川、云南、广西、福建、江西使君子两类,其中福建产地使君子聚为一小类,江西除永丰外也聚为一小类,四川、云南、广西使君子未有明显区分。结合元素聚类结果可知,重庆作为使君子的道地产区,产业化种植而使得无机元素分布较为相似,使君子中Ni、Mn、Cd、Cs、Ga、Co、Fe、Al、V元素含量普遍较高,福建使君子中Hg、Cu、As、Rb元素含量较高,江西使君子含有较高的Se、Pb元素,广西、云南、四川使君子均含有较高的Mg、K、Sr、Ca、Ba元素。由此可见,无机元素含量与种植环境、气候因素和地理因素有一定的相关性。

图2 使君子聚类热图分析结果

2.5.2主成分分析 采用SPSS 20.0版软件进行有监督的主成分分析以找到不同批次间具有代表性的特征无机元素,如表6所示,前6个主成分特征值均大于1,且累计贡献率达89.64%,即前6个主成分集中了原始数据的89.64%的信息。6个主成分因子根据表7旋转成分矩阵计算而得,计算公式如下:

表6 各主成分特征值、贡献率及累积贡献率

表7 旋转成分矩阵

F1=0.187X1+0.241X2+……-0.088X24+0.785X25

F2=0.111X1+0.921X2+……+0.065X24-0.005X25

F3=0.023X1+0.254X2+……-0.052X24+0.234X25

F4=0.877X1+0.037X2+……+0.046X24-0.068X25

F5=0.049X1+0.029X2+……+0.970X24-0.022X25

F6=-0.155X1-0.020X2+……-0.060X24+0.297X25

当以相关系数>0.8为衡量标准时,主成分1和Al、V、Fe、Co、Ga元素相关性较强,主成分2和Mg、K、Ca元素相关性较强,主成分3和Hg相关性较强,主成分4和Na相关性较强,主成分5和Ag、TI相关性较强,主成分6和Se相关性较强。所以确定Na、Mg、Al、K、Ca、V、Fe、Co、Ga、Se、Ag、Hg、TI是不同产地使君子中具有代表性的特征无机元素。

2.6健康风险评估 根据《中国药典》(2020年版)中药有害残留物限量制定指导原则及相关文献[18],可按照式(1)计算使君子中重金属及有害元素最大限量理论值:

L为最大限量理论值(mg·kg-1);A为每日允许摄入量(mg·kg-1bw),其中Pb为1.3 μg·kg-1;Cd为0.83 μg·kg-1;As为3.0 μg·kg-1;Hg为0.57 μg·kg-1;Cu为500 μg·kg-1;W为人体平均体质量(kg),以63 kg计;M为中药材(饮片)每日人均可服用的最大剂量(kg),以药典使君子项下最大用量12 g计;AT为平均寿命天数,以365 d/年×70年计;EF和ED为服用频率和服用年限,以90天/年和20年计;t为中药材及饮片经煎煮或提取后重金属元素的转移率(%),水煎煮条件下Pb、Cd、As、Hg、Cu的转移率分别为14%、14%、35%、24%、15%;10为安全因子,表示每日由中药材及其制品中摄取的重金属量不大于日总暴露量(包括食物和饮用水)的10%。

根据上述数值计算得使君子中Pb、Cd、As、Hg、Cu的理论最大限量值为69.20,44.18,63.88,17.70,24 840 mg·kg-1。而中医常按“君臣佐使”原则配伍服用中药以达到增效减毒的目的[19],考虑到处方累加的因素,当以P95 每日服用量500 g·d-1计算时,Pb、Cd、As、Hg、Cu的最大限量理论值分别为1.6,1.0,1.5,0.4,607 mg·kg-1,则重庆合川存在轻微Pb超标,福建3个批次存在轻微Hg超标。由此可见,重金属限量值与中药材每日服用总剂量及疗程等密切相关,单次少量服用不会对健康造成明显负面影响,长期大量服用则存在一定的健康风险。

3 讨论

使君子药材粉末经微波消解后仍有少量白色沉淀,通过改变升温程序、增加硝酸量及加入双氧水无明显改善,通过查阅文献[20]发现白色沉淀多为不溶性硅酸盐,尽管可以使用氢氟酸完全消解,但氢氟酸对玻璃仪器具有强烈腐蚀性,本实验未测定硅元素,因此采用孔径0.22 μm水系滤膜过滤得到样品液。此外,汞是唯一在环境温度和常压下呈液态的金属,其具有高度挥发性,因此每个样品中加入一定量的金离子产生金汞齐反应防止其挥发及测定后防止汞残留仪器[21]。

使君子所含常量元素中K元素含量丰富,而Na元素含量很低,说明使君子中有机酸多与钾离子结合。指纹图谱结果显示除Ag、Hg、TI、U微量元素外各产地使君子均含有相似的无机元素谱,但中药材的无机元素主要来源于土壤,研究发现土壤中阳离子交换量、pH、有机物、碳酸盐浓度能影响药材的元素吸收[22],即使同种元素在药材的不同部位因流动性不同含量也各不相同,Cd、Pb流动性小易在根部积累,而Ca、Mg、Mn、Cu、Zn元素流动性大,容易迁移到茎、叶、果实中[23],因此含量略有差异。聚类分析可大致分为重庆使君子和四川、云南、广西、福建、江西使君子两类,重庆使君子普遍含有较高的Ni、Mn、Cd、Cs、Ga、Co、Fe、Al、V元素,由此可以为使君子的道地产地研究提供依据。主成分分析显示Na、Mg、Al、K、Ca、V、Fe、Co、Ga、Se、Ag、Hg、TI可以作为评价不同产地使君子的特征无机元素。重金属及有害元素中Cu含量最高,但Cu是几种重要细胞酶催化所必需,缺乏或过载均会导致相关疾病[24],健康风险评估结果表明Cu、Hg、Pb、Cd、As元素健康风险可接受。综上所述,采用ICP-MS法结合指纹图谱、化学计量法和健康风险评估模型可快速、准确的对使君子中无机元素进行全面评价。