基于网络药理学探究当归芍药散入血成分治疗原发性痛经的有效性及机制*

赵蓝青青,李哲,刘孜,李娜,李忠思,刘振华,熊辉

(1.承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室,承德 067000;2.承德医学院省神经损伤与修复重点实验室,承德 067000;3.承德医学院基础医学研究所,承德 067000;4.承德医学院附属医院药学部,承德 067000)

当归芍药散最早见于《金匮要略》,由川芎、当归、泽泻、白术、芍药、茯苓六味中药组成[1],是中医临床治疗痛经的经典名方。其药理作用主要有改善内分泌、抑制炎症、调节平滑肌等,临床中多用于治疗原发性痛经、慢性盆腔炎、老年痴呆症、肾病综合征等疾病[2]。诸多临床应用表明,当归芍药散治疗痛经的疗效明显优于布洛芬[3]、去氧孕烯炔雌醇[4]、阿司匹林[5]等西药,且安全性高,未发现有明显的毒副反应。当归芍药散作为多成分、多靶点共同发挥作用的中药复方,治疗原发性痛经的药效物质及作用机制尚不完全明确。文献[6-8]对当归芍药散进行了入血成分研究,发现茯苓酸、Z/E-丁烯基酞内酯、泽泻醇B、藁本内酯、泽泻醇A、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸及其代谢产物12个主要血中移行成分,为当归芍药散的作用机制研究奠定了物质基础。

中药血清药物化学研究表明,口服药物发挥药理作用必须依赖于进入血液循环的药效物质[9],因此,以入血成分诠释作用机制,得出的结果更加客观、严谨。本研究针对筛选出的当归芍药散12个入血成分,借助网络药理学与分子对接技术,探究当归芍药散治疗原发性痛经的可能机制,并验证当归芍药散的有效性。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1当归芍药散入血成分及潜在作用靶点筛选 在中国知网及PubMed数据库进行2012—2022年当归芍药散组方入血成分的检索。在PharmGkb、TTD及SwissTargetPrediction平台查找其潜在作用靶标。

1.1.2原发性痛经相关基因靶点筛选 采用OMIM(http://www.omim.org/)数据库、GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库筛选并确定原发性痛经的相关基因靶点,关键词为“Primary Dysmenorrhea”。

1.1.3实验动物 SPF级雌性SD大鼠40只,体质量(200±20) g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,动物生产合格证号:SCXK(京)2019-0008。大鼠适应环境1周。所有实验按照承德医学院实验动物中心福利和伦理原则操作。

1.1.4材料与设备 当归饮片(批号:C25292012008)、川芎饮片(批号:C2472012004)、泽泻饮片(批号:C386-20212002)、白术饮片(批号:C2242012003)、白芍饮片(批号:C2232012004)、茯苓饮片(批号:C045210-4001),均购于河北莲花池药业有限公司,由承德医学院中药研究所赵春颖教授鉴定为正品。苯甲酸雌二醇注射液(4 mg·L-1,批号:210214);缩宫素注射液(10 U·mL-1,批号:210201),均购于上海全宇生物科技动物药业有限公司。布洛芬片(赤峰蒙欣药业有限公司,批号:2102019)。HZT-A1000型电子天平(美国康州电子秤科技有限公司,感量:0.01 g)、星海旋转蒸发器(无锡市星海生化设备有限公司)、SOIENTZ-18N型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1入血成分-靶点网络构建 利用R语言得到12种入血成分及筛选所得的原发性痛经疾病靶点的交集基因,通过Cytoscape3.6.1版软件完成入血成分-靶点网络构建,进行拓扑学分析。

1.2.2靶点生物过程与代谢通路分析 利用DAVID数据库研究基因本体(Gene Ontology,GO)生物学过程和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)信号通路分析,预测其治疗原发性痛经的主要机制,并将P值排序前二十的结果做气泡图进行可视化。

1.2.3分子对接 利用筛选出的复方关键成分和核心靶蛋白,采用AutoDock Vina 1.2.3版软件进行分子对接,最后将结合活性较强的结果利用PyMOL 2.4版软件绘制三维图进行可视化展示。

1.2.4动物实验评价当归芍药散治疗原发性痛经的有效性

①药物制备 当归芍药散灌胃液:称取饮片当归3 g、川芎8 g、泽泻8 g、茯苓4 g、白术4 g、芍药16 g,粉碎至50目筛,置于1000 mL圆底烧瓶加入10倍量50%乙醇浸泡60 min,加热回流2 h,药液经滤纸滤过;加入8倍量50%乙醇加热回流1.5 h。合并2次滤液,再次过滤,减压浓缩至无醇味,-40 ℃预冻后用冷冻干燥法制成疏松粉末,即当归芍药散冻干粉,以蒸馏水配置成浓度为0.33 g·mL-1的混悬液备用。布洛芬灌胃液:布洛芬片研至粉末状,以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配置成浓度为0.005 4 g·mL-1的混悬液备用。

②原发性痛经模型的复制 40只SD雌性大鼠按照随机数字表法分为对照组、原发性痛经模型组、阳性药组和当归芍药散组4组,每组10只。

造模方法参考文献[10],模型组、阳性药组与当归芍药散组皮下注射苯甲酸雌二醇10 d(第1、第10天,1 mg·kg-1;第2—9 天,0.5 mg·kg-1),第10天给药30 min后,给予缩宫素25 U·mL-1腹腔注射,对照组注射同等剂量的0.9%氯化钠溶液。造模后大鼠出现扭体反应且次数显著增多,即为模型复制成功。当归芍药散组以剂量10 mL·kg-1灌胃当归芍药散混悬液10 d,每天1次;阳性药组以剂量10 mL·kg-1灌胃布洛芬混悬液10 d,每天1次;对照组及模型组灌胃给予纯化水。末次给药60 min后,各组大鼠充分麻醉暴露腹腔,收集子宫组织,以10%甲醛溶液固定。

③当归芍药散有效性评价 观察并记录各组大鼠注射缩宫素后30 min内的扭体次数。造模及给药期间对各组大鼠进行体质量监测,并观察一般体征。

子宫组织置于10%甲醛溶液固定24 h以上,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(HE)染色,进行镜检观察。

1.2.5统计学分析 采用SPSS 25.0版软件进行数据分析,多组比较采用单因素方差分析,以GraphPad Prism 8.0作图,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1入血成分与原发性痛经靶点收集 当归芍药散中入血成分12个[6-8],其中当归中5个,川芎中7个,白芍中2个,泽泻中2个,茯苓中1个,白术中未发现入血成分,入血成分靶点296个,入血成分信息见表1。以“Primary Dysmenorrhea”为关键词,从OMIM及GeneCards数据库筛选出疾病靶点共517个,取交集得到入血成分与原发性痛经的靶点26个,见图1。

图1 药物与疾病的交集基因

表1 入血成分的基本信息

2.2入血成分-原发性痛经靶点网络 运用Cytoscape3.6.1版软件,以入血成分与疾病靶点构建“当归芍药散入血成分-疾病靶点网络”,可视化分析得531个节点,577条边,连线表示入血成分与疾病靶点之间的相互作用,见图2。

蓝色椭圆形代表入血成分;黄色方形代表入血成分与疾病交集靶点;紫色菱形代表疾病基因。

2.3PPI网络 通过STRING网站对共同靶点进行蛋白互作网络(PPI)分析,见图3,利用Cytoscape3.6.1版软件对数据进行可视化分析,度值越大,节点的颜色越深、图形越大;两点间连线越粗,节点间相互作用越强。其中核心靶点有VEGFA、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、ESR1、PTGS2等。

图3 蛋白-蛋白互作网络

2.4GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析得1603个富集条目(P<0.05),其中生物过程主要富集在调节炎症反应、调控细胞因子、调节内皮屏障、参与类固醇激素代谢、增强配体-受体活性、调节应答神经应激反应等方面,排名前十的富集结果见图4。筛选出68条信号通路(P<0.05),主要涉及IL-17、肿瘤坏死因子、MAPK、花生四烯酸代谢、雌激素等信号通路。KEGG分析排名前二十的条目见图5,所得气泡图中图形越大、颜色越绿,说明P值越小,富集越显著。

图4 GO富集分析

图5 KEGG 信号通路(前20条)富集分析

2.5分子对接 将入血成分-疾病网络筛出的关键成分与度值排名靠前的靶蛋白分子对接,结果显示结合能均为负值,数值越小表明二者之间亲和力越高,见表2。可视化分析发现,Z-丁烯基酞内酯、芍药内酯苷、洋川芎内酯I三个关键成分与各蛋白结合能力较强,各成分均与PTGS2结合能力最强,见图6。

图6 关键成分与核心靶点蛋白PTGS2对接

表2 关键成分与核心靶点的分子对接评分表

2.6当归芍药散有效性评价 注射缩宫素后30 min内模型组、阳性药组及当归芍药散组的扭体次数均显著高于对照组(0次)(P<0.01),模型复制成功;当归芍药散组及阳性药组扭体次数分别为(10.67±6.54)和(11.50±7.81)次,均显著少于模型组(27.8±11.19)次(P<0.01)。造模给药的10 d内模型组体质量较对照组增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.01),给药结束后当归芍药散组与模型组间体质量差异有统计学意义(P<0.05),见图7-A及图7-B。组织病理学分析,模型组较对照组出现严重子宫内膜剥脱及水肿;当归芍药散组及阳性药组较模型组子宫内膜剥脱及水肿程度明显减轻,见图8。综上,当归芍药散可改善由苯甲酸雌二醇联合缩宫素诱导的原发性痛经模型大鼠痛经反应。

①与对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05。

图8 4组大鼠子宫组织病理变化(×200)

3 讨论

原发性痛经(primary dysmenorrhea,PD)是生殖器官无器质性病变引起的痛经,主要症状包括下腹部痉挛性疼痛,伴有恶心、呕吐、腹泻、头晕等表现[11]。西医认为PD的病因可能与前列腺素、缩宫素、血管加压素、神经递质、遗传及心理等多种因素关系密切[12],常用治疗药物有解热镇痛类、激素类及非甾体抗炎药物,虽然疗效确切,但是易引起眩晕、头痛、胃肠道不良反应及产生耐药性[13]。当归芍药散作为中医治疗痛经的经典名方,已被制成颗粒剂广泛用于脾虚、肝郁、血虚等痛经的治疗。经动物实验验证,当归芍药散可显著减少PD模型大鼠的扭体次数和改善大鼠子宫内膜剥脱及水肿情况,为临床应用有效性提供佐证,当归芍药散的潜在作用机制值得深入研究。

本研究明确了当归芍药散12个入血成分治疗原发性痛经的26个关键靶点,通过分子对接筛选出洋川芎内酯I、Z-丁烯基酞内酯、芍芍药内酯苷3个与PD关键靶点结合较强的入血成分,可初步认为是当归芍药散治疗PD的药效物质基础。3种活性成分可通过下调炎症因子表达水平、诱导细胞凋亡、抑制细胞的周期性进程等方式发挥抗炎、抗氧化应激及保护血管等多重药理作用[14-16]。关键靶点TNF可诱导炎症反应和诱导细胞凋亡,对B细胞、T细胞、树突细胞的发育有突出作用[17];IL-6对子宫有收缩作用,诱导炎症反应,进而导致子宫上皮局部组织缺血缺氧引发痛经[18];VEGFA促进内皮细胞生长,扩张血管,增加血管通透性[19];ESR1刺激血清中肥大细胞释放疼痛物质而产生痛经[20];PTGS2促进前列腺素的合成,造成平滑肌痉挛性收缩导致痛经[21]。

KEGG通路主要富集在IL-17、TNF、MAPK、花生四烯酸代谢、雌激素、卵巢类固醇生成等信号通路,关键靶点中的TNF、IL-6、IL-1β、PTGS2等均在IL-17信号通路及TNF信号通路上有所富集。IL-17通路可抑制炎症因子、趋化因子的产生,缓解炎症,文献中缺乏IL-17基因的小鼠对各种病原菌的易感性显著增高,死亡风险增加[22-23]。TNF-α作为肿瘤坏死因子的一种亚型,促进IL-1、IL-6和IL-8等炎症介质的释放,参与炎症反应的调控[24]。MAPK信号通路[25-26]与炎症、肿瘤等疾病关系密切,MAP激酶对多种炎症细胞因子的表达起调节作用。综上,当归芍药散对原发性痛经的治疗作用,主要通过作用于关键靶点,调控激素效应、调节炎症因子的表达,抑制子宫的炎症反应来实现。

本研究基于当归芍药散的入血成分,通过网络药理学、分子对接技术及动物实验三种策略,分析其治疗原发性痛经的作用靶点、生物过程、信号通路及有效性,为今后全面认识当归芍药散的药理作用及临床价值提供思路与线索。