基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术分析藏药粗壮秦艽的化学成分

熊 波,桑吉东知,倪梁红,夏 云*

1.上海市宝山区中西医结合医院药剂科,上海 201999;2.西藏自治区藏医院生药研究所,拉萨 850000;3.上海中医药大学中药学院,上海 201203

粗壮秦艽GentianarobustaKing ex Hook. f.为龙胆科秦艽组多年生草本植物的根,分布于我国西藏南部,用药历史悠久,为藏药“解吉”的原植物来源之一,具有散风祛湿、清热利胆、舒筋止痛之功效,临床上主要用于治疗风湿性关节炎、低热盗汗、黄疸型肝炎、麻风毒热及各种出血肿胀等“赤巴病”[1-3]。粗壮秦艽是许多中成药的主要原料,如十三味榜嘎散、二十五味大汤丸等[4]。目前,对粗壮秦艽的研究主要集中在物种基原鉴定方面[5-10],仅有少量研究报道了粗壮秦艽中含有龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷等环烯醚萜类及部分栎瘿酸、谷甾醇等成分[11-12],随着对其药理作用和临床应用研究的推进,对其化学成分的快速表征成为急需解决的问题。

常规的中药化学成分分析方法包括提取、分离、鉴定和波谱结构解析等过程,整个过程繁琐、周期长、需要的技术成本高、损耗的资源多,并且由于对分离成分的盲目性,会导致被分离成分的重复或遗漏[13-15]。超高效液相色谱-电喷雾/四级杆飞行时间串联质谱联用(UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)技术具有高效、快速及分辨率、灵敏度、准确性均高的优点,在化学成分的定性分析中具有独特的优势,在中药化学成分的研究中占有重要的地位,与高效液相色谱(HPLC)法相比可大大缩短分析时间[16-18]。

本实验用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术对粗壮秦艽中的化学成分进行快速表征,用对照品及参考文献的数据对需要鉴定的化学成分进行结构鉴定[15],为粗壮秦艽化学成分的提取分离及药效物质基础研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC®-I-CLASS/XEVO G2-XS Qtof(沃特世科技有限公司);ME204E电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);DFY-X300高效多功能粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司);KQ-800DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ELGA超纯水系统(英国ELGA Lab Water公司)。

1.2 试药

对照品:马钱苷酸(批号P01A9L67130)、龙胆苦苷(批号Y30J9Q66926)、獐芽菜苦苷(批号Y25J10H91429)、獐芽菜苷(批号P25O10F101344),质量分数均大于98%,均购自上海源叶生物科技有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯(默克股份两合公司);水为ELGA系统纯化水;其余试剂均为分析纯。

粗壮秦艽于2019年10月采自西藏自治区山南市乃东区亚堆乡。经上海中医药大学中药学院倪梁红副教授鉴定为GentianarobustaKing ex Hook. f.的根,样品编号分别为CZ13-1、CZ13-2、CZ13-3、CZ14-1、CZ14-2、CZ14-3、CZ15-1、CZ15-2、CZ15-3;批号分别为CZ20191013-1、CZ20191013-2、CZ20191013-3、CZ20191014-1、CZ20191014-2、CZ20191014-3、CZ20191015-1、CZ20191015-2、CZ20191015-3。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

分别取粗壮秦艽样品,粉碎成粉,过60目筛,每份0.5 g,精密称定质量,分别置于锥形瓶中,加入体积分数为70%的甲醇25 mL,精密称定质量,超声处理(500 W,40 kHz)30 min,冷却,补足质量,取上清液,经0.22 μm滤膜滤过,即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

分别取马钱苷酸对照品、獐芽菜苦苷对照品、龙胆苦苷对照品、獐牙菜苷对照品,精密称定,用甲醇溶解,分别制成含马钱苷酸1.0 mg·mL-1、獐芽菜苦苷1.06 mg·mL-1、龙胆苦苷1.0 mg·mL-1、獐牙菜苷1.04 mg·mL-1的对照品储备液。分别吸取上述储备液马钱苷酸200 μL、獐牙菜苦苷100 μL、龙胆苦苷500 μL、獐牙菜苷50 μL,加甲醇至2 mL,混合均匀,即得马钱苷酸100 μg·mL-1、獐牙菜苦苷50 μg·mL-1、龙胆苦苷260 μg·mL-1、獐牙菜苷26.5 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B),流速为0.4 mL·min-1;柱温为40 ℃;进样量为1 μL;梯度洗脱条件为0～ 5 min,95% A;5～10 min,95%～88% A;10～15 min,88%～72% A;15～20 min,72%～45% A;20～25 min,45%～20% A;25～30 min,20% A。

2.4 质谱条件

电喷雾(ESI)离子源,正、负离子模式下的Continuum模式。扫描范围为m/z100～1 200 Da,扫描时间为0.1 s,毛细管电压正离子为3 000 V,负离子为2 500 V;喷嘴电压为40 V;干燥气流速为800 L·h-1;离子源温度为120 ℃;碰撞气体为氩气;碰撞能为20～50 eV,用Lock Mass通路对采集的实验数据进行实时校正。

2.5 数据采集与筛选

用MassLynx 4.1软件采集、管理和筛选UPLC-Q-TOF-MS/MS数据。根据出峰情况,进行数据采集,在正式分析样本前,根据出峰情况,需进2～3针所有样品的混合物(QC)以平衡系统,然后每隔8～10个样本进1针QC,用于检测和评估在组学样本采集过程中仪器的稳定性及实验数据的可靠性。通过对所有样品的总离子流图(TIC)进行比较,筛选代表性样品进行质谱解析。

2.6 数据分析

通过UNIFI©科学信息系统进行数据的浏览、存储和综合分析等。设置一定的筛选条件,根据测得的精确相对分子质量设置一定的误差范围,一般为±6 ppm(1 ppm=1×10-6,下同),计算可能的元素组成,基于其内置的质谱分析平台,包括ChemSpider在线数据库(PubMed、PubChem、MassBank等)和中药数据库(TCM Chiese[UNIFI1.9])进行自动匹配及筛选。结合保留时间、提取的MS和MS/MS质谱图和相关碎片信息,综合文献已报道的秦艽化学成分、裂解规律和对照品信息进行筛选和鉴定,完成其主要化学成分的判别分析。

2.7 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS定性分析结果

在色谱、质谱条件下,测定正、负离子模式下的总离子流图,粗壮秦艽居群1批号CZ20191013-1样品的总离子流图见图1。用UNIFI软件对质谱数据进行分析,通过高分辨质谱信息推测其可能的分子式,质谱偏差范围δ≤2.23×10-6。通过质谱信息结合秦艽数据库和相关文献,对化合物进行指认并结合化合物的质谱及其裂解规律对化合物进行分析和鉴定。共鉴定出39 个化合物,结果见表1。

表1 粗壮秦艽的化学成分质谱鉴定结果

注:A.负离子模式;B.正离子模式;1.蔗糖;2.8-羟基-10-羟基獐芽菜苷;3.8-表番木鳖酸;4.secologanic acid;5.马钱苷酸;6.山栀苷甲酯;7.莫诺苷;8.secologanoside;9.秦艽苷A;10.3′-O-β-D-葡萄吡喃糖基-龙胆苦苷;11.獐芽菜苦苷;12.紫药苦苷;13.龙胆苦苷;14.红白金花内酯;15.阿魏酸;16.8-O-乙酰山栀苷甲酯;17.2′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷;18.獐芽菜苷;19. 4′-O-β-D-葡萄吡喃糖基-龙胆苦苷;20.异荭草素;21.1H-2-benzopyran-1-one, 8-(β-D-glucopyranosyloxy)-3,4-dihydro-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-,(3S)-;22.皂草黄苷;23.异牡荆苷;24.大叶苷C;25.大叶苷D;26.rindoside;27.gentimacroside;28.三花苷;29.2-甲氧基鳝藤酸;30.1β,2α,3α,24-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid;31.2α,3β,24-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid ;32.1α,2α,3β,24-tetrahydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid;33.3β,6α,24-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid ;34.3,24-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid;35.齐墩果酸;36.熊果酸;37.豆甾醇;38.栎瘿酸;39.科罗索酸。

2.7.1环烯醚萜类成分鉴定 环烯醚萜是一类特殊的单萜化合物,多具有环戊烷及半缩醛的结构特点。在二级质谱图中,环烯醚萜类化合物通常会丢失中性分子(如CO2、H2O)、脱去糖等及二氢吡喃环的断裂[19]。

峰5的母核离子m/z375,在负离子模式下响应值较好,加合物为[M-H]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C16H24O10。其在二级质谱图中的特征碎片离子有m/z213[M-H-C6H11O5]-,m/z[M-H-C6H11O5-CHO2]-,m/z151[M-H-C6H11O5-CHO2-H2O]-,m/z125,m/z113,m/z107。其中m/z169、m/z125、m/z107是二氢吡喃环上的开裂。m/z151是在m/z169的基础上失去一个H2O。m/z113是母核只剩下糖链。根据峰5的质谱信息及裂解规律,结合文献并与马钱苷酸对照品的质谱信息对比,鉴定峰5为马钱苷酸,相应的二级质谱图见图2。

注:A.马钱苷酸;B.獐芽菜苦苷;C.龙胆苦苷;D.獐牙菜苷;E.科罗索酸;F.皂草黄苷。

峰11的母核离子m/z419,加合物为[M+HCOO]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C16H22O10。其在二级质谱图中的特征碎片离子有m/z141[M+HCOO-C10H17O6]-。m/z141是糖苷键断裂丢失环烯醚萜母核后留下的碎片。根据峰11的质谱信息及裂解规律,结合文献并与獐芽菜苦苷对照品的质谱信息对比,鉴定峰11为獐芽菜苦苷,相应的二级质谱图见图2。

峰13的母核离子m/z401,加合物为[M+HCOO]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C16H20O9。其在二级质谱图中的碎片离子有m/z193[M+HCOO-C6H11O5]-、179[M+HCOO-C10H9O3]-、149[M+HCOO-C7H12O7]-。其中m/z193是糖苷键断裂失去一个糖分子,m/z179是环烯醚萜母核的丢失,m/z149是环烯醚萜母核上二氢吡喃环断裂后留下的碎片。根据峰13的质谱信息及裂解规律,结合文献并与龙胆苦苷对照品的质谱信息对比,鉴定峰13为龙胆苦苷,相应的二级质谱图见图2。

峰18的母核离子m/z403,加合物为[M+HCOO]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C16H22O9。其在二级质谱图中的特征碎片离子有m/z195[M+HCOO-C6H11O5]-、m/z125[M+HCOO-C10H17O6]-,其中m/z195是糖苷键断裂失去一个糖分子,m/z125是糖苷键断裂失去环烯醚萜母核和糖上的部分侧链。根据峰18的质谱信息及裂解规律,结合文献并与獐芽菜苷对照品的质谱信息对比,鉴定峰18为獐芽菜苷,相应的二级质谱图见图2。

2.7.2三萜类成分鉴定 三萜的裂解规律[20]:①当C环内有双键时,一般都有较特征的逆狄尔斯-阿尔德反应(retro Diels-Alder reaction,RDA反应)裂解;②当C环内无双键时,则常从C环断裂成2个碎片;③有时RDA裂解和C环断裂同时发生。

峰39的母核离子m/z471,在负离子模式下响应值较好,加合物为[M-H]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C30H48O4。其在二级质谱中的特征碎片离子有m/z427[M-H-COOH]-、m/z409[M-H-COOH-OH]-、m/z393[M-H-COOH-OH-CH2]-、m/z125[M-H-C22H34O2-OH]-,其中m/z427、m/z409、m/z393均为侧链断裂,m/z125是化合物A环、B环同时断裂所得到的碎片离子峰。根据其高分辨质谱信息、碎片离子信息、裂解规律及相关文献推测峰39为科罗索酸,相应的二级质谱图见图2。

2.7.3黄酮类成分鉴定 黄酮类化合物是一类C6-C3-C6单元的含氧杂环天然有机化合物,生物合成途径为桂皮酸途径。在二级质谱中,黄酮苷元主要发生RDA裂解。黄酮苷元通过RDA裂解产生的主要碎片离子是通过C环上的C-C和C-O键的断裂产生的Ai,j、Bi,j离子,i和j为C环上断裂键的位置,常见的碎片还有中性分子,如CO、CO2、H2O等[21]。

峰22的母核离子m/z639,加合物为[M+HCOO]-,在质谱偏差范围δ≤2.23×10-6的条件下,通过高分辨质谱推测其分子式为C27H30O15。其在二级质谱中的特征碎片离子有m/z315[M+HCOO-C14H15O6]-、m/z281[M+HCOO-C14H17O8]、m/z153[M+HCOO-C20H25O11]-。其中m/z315是化合物黄酮C环1和2位C-O键的断裂、3和4位C-C键的断裂以及A环上7位糖苷键断裂失去一分子糖得到的分子离子峰,m/z281是母核上脱去一个B环、A环上7位糖苷键断裂失去一分子糖以及A环上6位所连糖分子上部分键发生断裂所得到的分子离子峰,m/z153.017 17是化合物黄酮C环1和2位C-O键断裂、3和4位C-C键断裂以及A环上6和7位糖苷键断裂失去两分子糖得到的分子离子峰。根据其高分辨质谱信息、碎片离子信息、裂解规律及相关文献推测峰22为皂草黄苷,相应的二级质谱图见图2。

2.7.4其他类成分鉴定 粗壮秦艽的其他类成分包括糖类、甾类、氧萘类、有机酸类、酯类等。峰1的保留时间tR为0.59 min,在负离子模式下有较好的响应值,加合物为[M-H]-,根据高分辨质谱信息、碎片离子信息、裂解规律及相关文献,鉴定峰1为蔗糖。峰15的保留时间tR为5.72 min,在正离子模式下有较好的响应值,加合物为[M+H]+,根据高分辨质谱信息、碎片离子信息、裂解规律及相关文献,鉴定峰15为阿魏酸。峰24的保留时间tR为10.86 min,在负离子模式下响应值较好,加合物为[M+HCOO]-,根据高分辨质谱信息、碎片离子信息、裂解规律及相关文献,鉴定峰24为大叶苷C。

3 讨论

本研究首次用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术在正、负离子模式下对粗壮秦艽中各化学成分进行了化学成分定性分析,通过各色谱峰在质谱中的精确相对分子质量、碎片信息、质谱裂解规律和色谱保留规律,并结合对照品的质谱信息和参考文献,鉴定出粗壮秦艽中的39个化合物,主要包括环烯醚萜类、三萜类和黄酮类。对所有居群的粗壮秦艽样品进行分析,共检出35个共有成分。在CZ13居群中检测出全部的39种成分,在CZ14居群中未检测到gentimacroside、红白金花内酯和阿魏酸,在CZ15居群中未检测到gentimacroside、三花苷。不同居群粗壮秦艽中未检测出的成分各有不同,这可能与其所处地理环境及土壤等因素不同有关,针对这些差异化合物可进一步深入研究,或可考虑将其作为鉴定粗壮秦艽真伪的特征性成分,为建立粗壮秦艽的质量综合评价体系提供参考。

《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)规定的秦艽品种野生资源严重匮乏,临床用药供应不足,而广泛分布于我国西南、西北地区的粗壮秦艽,资源较丰富,本实验为鉴定粗壮秦艽中具有生物活性的成分提供了一种快速、简便、可靠的手段,可为粗壮秦艽药效物质基础、质量评价等方面的研究提供数据支撑,为确定《中国药典》中规定的秦艽的替代资源提供一定科学实验依据。