BRD4抑制剂JQ1通过超级增强子相关lncRNAs影响宫颈癌患者的预后研究*

郑建清 黄碧芬 苏晓宁 曾冰微

1 福建医科大学附属第二医院放射治疗科,福建省泉州市 362000; 2 泉州医学高等专科学校附属人民医院妇产科; 3 福建医科大学附属第二医院医保办; 4 福建医科大学附属第二医院病理科

宫颈癌是全球妇女第二位常见的恶性肿瘤[1],而中国长期流行病学资料显示,宫颈癌发病率始终高居妇科肿瘤第一位,是女性防控任务艰巨的恶性肿瘤之一[2]。尽管手术和(或)放化疗对宫颈癌治疗有效率高达70%～75%,仍有30%～40%转移性宫颈癌或复发性宫颈癌缺乏有效治疗手段[3-4]。近年来发现,超末端家族蛋白(Bromodomain and extraterminal domain,BET)是溴结构域蛋白(Bromine Domain Protein,BRD)核转录因子家族中一类全新的转录调控蛋白,他们可以募集多种转录激活子来促进转录激活,参与恶性肿瘤的发生发展[5]。JQ1是一种BRD4抑制剂,可以抑制BET蛋白家族的促转录功能,进而抑制肿瘤进展,被认为是未来治疗肿瘤的潜在新药物[6]。体内外研究表明,JQ1对宫颈癌HeLa细胞的生长具有抑制作用[7]。一些研究发现,JQ1对肿瘤相关超级增强子具有显著抑制作用,是JQ1发挥抗肿瘤作用的重要机制之一[8],但JQ1是否参与宫颈癌HeLa细胞超级增强子的调控尚未见报道。我们的先前研究表明,JQ1对宫颈癌HeLa细胞的增殖、侵袭能力具有抑制作用[9]。为了探讨JQl是否通过调控超级增强子相关lncRNA(Super enhancer-associated lncRNAs,SE-lncRNAs)表达谱发挥对宫颈癌HeLa细胞的抗肿瘤作用,本研究进一步通过全转录组测序,获得了JQl处理和对照组的表达谱,并结合TCGA(The cancer genome atlas)数据库进行预后分析,现对其结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测JQ1对宫颈癌HeLa细胞的最佳抑制浓度和作用时间 人宫颈癌HeLa细胞系经细胞培养合格后,采用CCK8法检测JQ1对HeLa细胞株增殖的影响。HeLa细胞分别采用0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L浓度的JQ1处理,获得不同JQ1浓度对HeLa细胞增殖的抑制率。具体试验过程参照本课题前期的报道[9],JQ1处理HeLa细胞72h后,细胞增殖抑制率为(50.82±1.43)%。

1.2 全转录组测序及数据分析 取对数生长期的HeLa细胞接种于六孔板,细胞数目为2×105/孔,培养12h。其中3孔采用1μmol/L JQ1进行处理,设置为处理组,另外3孔不加入JQ1,设置为对照组,培养72h,按照RNA提取试剂盒的说明书提取细胞总RNA,基于NEBNext Ultra RNA库制备试剂盒构建RNA测序文库,使用Illumina Hiseq 4000测序平台完成转录组测序。本研究测序工作由厦门生命互联科技有限公司完成。试验重复3次。

Illumina Hiseq 4000测序平台获得的FASTQ格式的原始数据,采用TopHat软件和Cufflinks软件处理后,获得表达谱数据,随后采用“limma”包进行差异表达分析,差异表达条件设置为:Log2fold change(LogFC)绝对值>1,且校正P值<0.05。

SE-lncRNAs基因目录提取自Soibam报道的结果[10]。提取完成后,从JQ1处理组和对照组表达矩阵中提取SE-lncRNAs数据集,进行后续分析。

1.3 TCGA数据的下载与处理 在TCGA 数据库官方网站(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载宫颈癌表达谱和临床信息等数据。TCGA宫颈癌序列包含组织样本307例,正常宫颈组织样本3例,其中随访时间≥1个月的宫颈资料265例。利用R4.2.0软件及其相应R包对下载的基因表达数据进行归一化整理,并通过log2转化后用于后续分析。相应的宫颈癌临床病理特征信息,仅保留生存时间、生存状态完整的患者数据。

1.4 统计学方法 采用R 4.2.0软件中的“survival”包、“survminer”包等进行生存分析,COX比例风险回归模型用于评价基于表达的预后价值,Kaplan-Meier 法绘制生存曲线。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SE-lncRNAs筛选与差异分析结果 从全转录组测序中获得基因表达矩阵,采用“biomaRt”包进行基因注释,以表达总和超过1为基因筛选条件,通过6个样品获得总共3 111个lncRNAs,其中88个lncRNAs表达上调,105个lncRNAs表达下调。随后,根据Soibam的报告[10]筛选和匹配了162个SE-lncRNA。使用校正P值(False Discovery Rate,FDR)=0.05和LogFC>1作为差异条件,共筛选出15个差异表达的SE-lncRNAs,见表1。

表1 JQ1处理后超级增强子相关lncRNA表达差异分析结果

2.2 差异表达SE-lncRNAs的预后分析 采用COX回归分析探索差异表达SE-lncRNAs的预后价值,结果见表2。共发现4个SE-lncRNAs对宫颈癌预后具有显著影响,分别是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021对宫颈癌的总生存具有显著影响(P<0.05);其中LINC01106表达增高组,患者预后较差,而SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021高表达组患者预后较好,差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021在宫颈癌中的生存曲线图

表2 宫颈癌患者差异表达SE-lncRNAs的COX回归分析结果

3 讨论

晚期宫颈癌占全部宫颈癌患者的30%～35%,通常以全身化疗为主要治疗手段,但疗效差,5年生存率不足35%,被认为是不可治愈[11]。尽管靶向治疗或免疫治疗在晚期宫颈癌患者中取得了一定效果,但与单纯化疗相比,其疗效并未明显提高[12]。因此,寻找针对宫颈癌的高效靶向药物,对提高宫颈癌,特别是晚期宫颈癌患者的预后,具有重要的现实意义。

JQ1是一种分子结构与BRD4相似的小分子抑制剂,可与BRD4竞争性结合到BRD4结构域上,使BRD4的生物学被竞争性抑制,而BRD4-BRD4结构域共同参与了恶性肿瘤的生物学过程。JQ1作为单一药物应用于某些实体恶性肿瘤具有明显的抑制作用,提示JQ1在抗肿瘤应用领域具有广阔前景[5-6,13]。我们前期研究表明,JQ1对宫颈癌HeLa细胞具有明显抑制作用,说明JQ1对宫颈癌亦能发挥抗肿瘤作用,但我们的前期研究尚未深入涉足JQ1对宫颈癌的抗癌机制探索[9]。在本次报告中,我们通过转录组测序,进一步从基因表达层面对JQ1干扰HeLa细胞增殖的机制进行分析,为揭示JQ1的抗癌机制提供理论基础。

本研究聚焦于超级增强子相关lncRNAs的差异性表达在宫颈癌中的预后价值。2013年,Richard等人首次提出了超级增强子(super-enhancers,SE)的概念[14],随后Soibam提出并鉴定出了超级增强子相关lncRNAs[10]。SE-lncRNAs属于长非编码RNA(lncRNAs)的一个亚组,其异常表达已在多种肿瘤中被报道。然而,超级增强子介导SE-lncRNAs参与癌症发生、发展的具体机制仍然不清楚,目前认为,超级增强子通过募集转录子,强化了SE-lncRNAs的表达,并通过下游基因发挥肿瘤调控作用[5]。在本研究中,我们鉴定出15个与JQ1处理有关的差异表达的SE-lncRNAs,提示SE-lncRNAs表达谱的改变,是JQ1发挥抗癌作用的重要机制。我们进一步结合TCGA数据库,分析了差异表达SE-lncRNAs在宫颈癌中的预后价值。我们共发现4个SE-lncRNAs对宫颈癌预后具有显著影响,分别是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021对宫颈癌的总生存具有显著影响(P<0.05)。LINC01106已被证明是一种促癌因子,其表达水平增高与直肠癌预后变差有关[15]。我们的转录组测序表明,JQ1抑制了LINC01106的表达,这与TCGA数据分析结果相符,我们的研究为未来探讨LINC01106作为JQ1靶点提供了思路。SNHG14已被发现对子宫内膜癌的预后有显著影响[16]。ITGB2-AS1被发现可以促进透明细胞肾细胞癌的进展[17]。而LINC02021在肿瘤中的具体机制与表现尚未见表达,未来可以通过该基因作为切入点,探讨其在宫颈癌等恶性肿瘤中的价值。

综上所述,JQ1具有显著抑制HeLa细胞增殖的能力。JQ1可能通过改变超级增强子相关lncRNAs的表达谱,进而影响宫颈癌的总生存。SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021、LINC01106等基因的不同表达状态,对宫颈癌的预后具有显著影响,但其具体机制,还需要未来开展实验研究进一步探索。