PDCA循环法在免疫组化染色质量控制中的应用案例

袁建青 丘利祥 张美先 陈 迪 暨南大学附属顺德医院病理科,广东省佛山市 528305

免疫组织化学染色是一种重要的病理诊断技术,依据抗原抗体特异性结合的原理,通过对抗体进行特殊标记、显色,可以检测到样本组织内是否存在特异性抗原,从而达到区分组织来源、鉴别肿瘤良恶性、指导特异性靶向治疗的目的[1]。但是作为一种实验技术手段,免疫组化染色的结果会受到多种因素影响,难免出现染色不佳的情况,对免疫组化染色的质量控制是病理科日常工作中的重要组成部分,各级管理部门亦对此提出了相应要求,如何有效解决免疫组化工作中出现的问题,不断提高工作质量并将其保持在稳定的高水平状态对病理诊断工作的开展是一个不可忽视的问题。我科工作中发生一起GATA结合蛋白3(GATA-3)抗体免疫组化染色不良事件,质控小组应用PDCA循环,最终使问题得以解决,现汇报如下。

1 材料

1.1 实验材料 GATA-3是转录因子GATA家族成员,广泛表达于乳腺导管上皮细胞,显色于细胞核,常被用于鉴别癌组织是否来源于乳腺[2]。实验材料选用4个不同患者来源的乳腺组织蜡块。

1.2 试剂及设备 免疫组化染色使用基因公司GT-Stainer免疫组化染色仪,一抗(GATA-3)为厦门通灵生物公司即用型抗体,二抗及辅助试剂如修复液、清洗液等均为基因公司配套免疫组化染色机专用试剂,免疫组化防脱片为世泰公司产品,免疫组化染色方法为二步法。

2 方法

2.1 制定计划(Plan)

2.1.1 发现问题:我科免疫组化GATA-3抗体染色结果出现问题,阳性对照正常乳腺组织内GATA-3染色强度减弱,阳性细胞比例极低,不足5%,甚至完全阴性。因以往实验中该抗体在阳性对照组织中表达较稳定,故初步判断为偶然事件,随即于当日进行不同对照组织的第2次染色,染色结果并无明显改善。

2.1.2 分析问题:从人、机、料、法、环五个方面着手分析,见1图。

图1 免疫组化染色效果问题分析

2.1.2.1 人员:我院为基层医院,开放床位700余张,病理科人员配备紧凑,共有医师4名,技师4名,科室助理1名,为保证工作质量的稳定,所有技术岗位采取轮转制,由4名技师每周进行1次轮换,4名技师均能熟练操作免疫组化染色设备,科室制定有免疫组化染色的操作规程和相关实验室制度,经询问当班技师,其所有技术操作均与以往无异,人为操作失误可能较小。

2.1.2.2 仪器设备:我科使用基因生物有限公司GT-Stainer免疫组化染色仪,及配套的GT-R100抗原修复仪,所有仪器设备均制定有质控表格,经质控小组现场检查,所有设备运行良好,近期无故障及维修记录,且同一批次免疫组化染色,其他抗体阳性对照表达正常,机器故障因素基本排除。

2.1.2.3 物料:本次实验所用样本及对照组织均为乳腺组织,其固定时间、固定液种类、固定液用量均按相关规定执行,且2次实验已选用不同对照蜡块,实验所用样本及对照组织引起实验结果偏差可能较小。所有抗体、试剂、玻片购置、入库均按照院科两级相关制度进行,经检查相关登记表,所有抗体、试剂及器材均未超过有效期,但GATA-3抗体为新近购置的2支抗体之一,入库时虽然经过有效性验证,但是否是该支抗体则存疑,而同一批实验其他抗体显色均正常,所使用试剂中只有一抗不同,因此一抗(GATA-3即用型抗体)引起实验结果偏差的可能较大。

2.1.2.4 实验方法:我科免疫组化染色所用方法为二步法,2018年10月开始使用基因公司GT-Stainer免疫组化染色仪,相关操作流程为基因公司工程师经过现场实验调整设置,未有变动,免疫组化染色结果相对稳定,染色质量有过小的波动,但未曾出现过阳性对照完全阴性的情况,经质控小组调查,不同技师切片时,蜡片厚度选择3.5μm或4μm,略有不同,其后实验过程基本一致,切片后用免疫组化防脱玻片捞片,72℃温箱烤片1h,将切片以专用玻片架放置入抗原修复仪脱蜡修复20min,修复完成后,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min,玻片上机,启动免疫组化染色机日常工作程序,这一步操作过程无须手工操作,完全由仪器按预定程序进行,包括添加一抗、二抗及苏木素复染,染色完成后,使用封片机以中性树胶封片。经质控小组分析讨论,不同技师操作过程基本相同,不至于引起阳性对照完全阴性的结果,实验方法、流程引起GATA-3抗体显色不佳的可能性不大。

2.1.2.5 环境:该次实验时天气状况良好,室温、湿度变化不大,实验用水为医院直供反渗法制备的纯净水,且同批次其他抗体表达良好,环境影响可能性小。

2.1.3 查找原因:结合以上调查结果,质控小组讨论后认为试剂(GATA-3即用型抗体)原因导致实验失败的可能性较大。

2.1.4 设定目标,制定计划:计划针对人、机、料、法、环五个方面分别采取对照试验,以达到明确原因,解决问题的目的,目标为正常乳腺组织GATA-3抗体免疫组化染色细胞核呈明显的棕黄色,阳性细胞≥80%,争取1周内解决问题。

2.2 执行计划(Do)

2.2.1 排除人为操作失误及样本因素:选取2个正常乳腺组织蜡块,4μm切片,捞于同一玻片,共制片2张,由2名技师分别进行GATA-3抗体免疫组化染色,染色步骤及其他实验条件相同,2名技师染色结果基本一致,所有乳腺组织GATA-3表达均不理想。

2.2.2 排除仪器故障因素:选取2个正常乳腺组织蜡块,4μm切片,捞于同一玻片,共制片2张,由同一名技师分别进行GATA-3抗体免疫组化手工和机器染色,染色步骤及其他实验条件相同,染色结果显示手工染色阳性细胞数及染色强度略好于机器染色结果,但阳性细胞<10%,未达计划目标要求。

2.2.3 排除样本及试剂因素:分别将我科用于实验的同一乳腺组织样本白片寄送厦门通灵公司及上海基因公司,由以上公司实验室进行GATA-3抗体染色,2家公司染色结果均为正常显色,提示可以排除样本因素。将我科剩余GATA-3抗体寄送通灵公司,由其进行GATA-3抗体染色,染色结果均为正常显色,提示可以排除试剂因素。由通灵公司及基因公司分别提供新的GATA-3即用型抗体一支,选取2个正常乳腺组织蜡块,4um切片,捞于同一玻片,共制片2张,由1名技师用2支抗体分别进行GATA-3抗体免疫组化染色,染色步骤及其他实验条件相同,染色结果基本一致,所有乳腺组织GATA-3表达均不理想。

2.2.4 排除环境因素:所有实验均在室温26℃(空调)下进行,除GATA-3抗体外,同时期其他抗体显色均正常,环境因素可以排除。

2.3 检查工作(Check) 经过以上步骤排查,质控小组认为可以排除人员、仪器、试剂、环境等因素造成GATA-3抗体染色不佳的可能性,提示染色方法及流程引起此次事件的可能较大。

2.4 处理(Action) 经查阅GATA-3抗体和二抗使用说明书,及通灵公司、基因公司产品手册中与免疫组化染色操作步骤相关的内容,发现GATA-3抗体说明书中建议在染色时,先对脱蜡后的组织切片进行封闭,再进行抗原修复,与我科日常工作流程不相符,为此质控小组决定修改染色流程,将先修复再封闭改为先封闭再修复,并重新进行实验。此次实验,乳腺腺泡及导管上皮细胞核呈明显的棕黄色,阳性细胞>90%,GATA-3抗体显色正常。

3 结果

为了验证效果,质控小组再次复查以上PDCA循环流程,并分别使用通灵公司及基因公司的GATA-3即用型抗体,以新的染色操作流程对乳腺组织进行染色,实验结果乳腺腺泡及导管上皮细胞核显色正常,完全达到计划目标,因此,质控小组决定对GATA-3免疫组化染色操作流程进行修改,以保持染色效果。此次PDCA循环的运行,也暴露出科室抗体管理、工作流程等方面的一些漏洞和疏忽,质控小组要求以后在抗体入库做有效性检验时记录要更加详细,同时技术组要在抗体入库时详细阅读使用说明书,对有特殊处理要求的抗体要记录在案。

4 讨论

免疫组织化学染色操作简便,对实验设备及环境要求低,成本相对低廉,易于在基层医院开展,对病理诊断及鉴别诊断有着不可替代的重要作用,但是免疫组化染色的结果易受人员、设备、试剂、操作流程、环境等多种因素影响,日常工作中难免会出现染色不良的事件,如何快速有效的发现并解决主要问题,对病理质控工作的开展是一项挑战。PDCA循环是由1924 年美国人Waller Shewhart 提出,并由Deming改进后的一种管理方法[3],通过Plan(计划)、Do(执行)、Check(检查)、Action(处理)这四个阶段的循环进行,可以达到解决问题,改进质量的目的。作为一种先进的管理方法,PDCA循环已被用于病理石蜡切片HE染色、特殊染色及免疫组化染色的持续改进工作中,并取得了良好的效果[4-6]。

此次我科GATA-3抗体免疫组化染色结果不良问题出现后,科室随即进行了重复实验,排除了偶发事件的可能,面对以上纷繁复杂的多种因素,质控小组决定应用PDCA循环,来查找原因,并解决问题。首先质控小组与此次实验的操作人员进行了谈话,了解了详细的实验过程,并查看了相关的工作记录及试剂出入库、验证记录等文书,结合设备状态及实验环境,初步做出了判断,认为实验结果不良可能是试剂原因造成。为了验证这种想法进而制定了对应的工作计划,从人、机、料、法、环五个方面着手,分别进行对照实验。实验结果却推翻了质控小组的初步判断,新的抗体显色仍然不良,而上述怀疑有问题的抗体在送去试剂公司实验后却显色正常,结合其他方面的验证结果,实验方法及流程错误的可能性反而更大。在第二轮PDCA中,发现GATA-3抗体说明书中建议在染色时,先对脱蜡后的组织切片进行封闭,再进行抗原修复,与我科日常工作流程不相符,与免疫组化染色仪厂家设定的固有程序不同,有可能是导致染色不良的主要原因,在采取相应改进并实验验证后,问题得以圆满解决。通过此次PDCA循环的应用,笔者深刻地认识到,在遂行PDCA循环,分析事件原因时要保持严谨、客观的工作态度,以免做出错误的判断,我科在第一轮PDCA循环中,忽略了一抗与二抗分属不同厂家,实验流程可能不同的情况,仅主观地依据日常工作经验,未能对抗体说明书等资料进行认真核对,错误认为染色不良是由试剂引起的,幸而接下来的计划、执行与检查步骤较为完善,为查明问题的主要原因提示了方向,这进一步验证了PDCA循环的可行性,显示在免疫组化染色质量控制中使用PDCA循环法,对于分析、查找出引起问题的主要原因,可以做到步骤明确,条理清晰,客观明了,可不断提升和持续改进病理工作质量,是一种有效的管理方法。同时也提醒,再良好的工具,在使用时也必须以认真负责的工作态度加以对待,才能使其发挥出真正的作用。