对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母工程菌呋喃酮产量及菌体的影响

彭辉，潘百玲，李忍，邓景致，李志江，2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心）

鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）可以在高盐高糖或偏酸性的环境下生长，在传统发酵食品增香中具有重要增香作用，是酱油和豆酱等酿造时主要的发酵剂和增香菌株[1]。4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2，5-dimethyl-3（2H）-furanone，HDMF）是一种类似菠萝风味的香料，首次在菠萝中分离得到，在食品和烟草行业中具有较高的商业价值[2]。

天然HDMF 主要利用微生物合成法生产，Z.rouxii是被报道用于微生物合成HDMF 常见的菌种[3]。果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-bisphosphate，FBP）是鲁氏酵母菌代谢产生HDMF 的重要前体物质[4]，经2，3-烯醇化和脱磷酸作用后，形成的1-脱氧-2，3-邻酮-6-磷酸-己糖经去磷酸和NAD（P）H-醌氧化还原酶1 〔NAD （P）H：quinone oxidoreductase，NQO1〕作用，得到中间产物4-羟基-5-甲基-2-亚甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-3（2H）-furanone，HMMF）。烯醇式HMMF 经线粒体内醌氧化还原酶（Quinone oxidoreductase，QOR）作用，在酵母体内独立的被转化为HDMF[5]。因此，QOR 是酵母菌利用FBP 代谢合成HDMF 重要催化酶。

酚类物质在有氧条件下易被氧化成醌类化合物。醌类物质自发失去电子变成半醌，在QOR 催化下将半醌还原为对苯二酚，对苯二酚在有氧条件下被再氧化成半醌中间体，形成QOR 催化还原反应的底物[6]。对苯二酚和1，4-萘醌是QOR 催化的底物，QOR 催化邻位醌和1，4-萘醌的效率最高[7]，但在鲁氏酵母菌中鲜有利用外源酚和醌类物质底物提供鲁氏酵母菌代谢合成HDMF 报道。因此，研究利用鲁氏酵母QOR基因过表达工程菌为菌株，在反应体系中添加对苯二酚和1，4-萘醌，为QOR 提供外源底物使鲁氏酵母菌代谢合成HDMF。旨在提高鲁氏酵母菌代谢合成HDMF 提供数据支撑，为推进HDMF 的产业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株及培养基

鲁氏酵母菌中国普通微生物菌种保藏管理中心（菌种保藏编号为No.32899）；鲁氏酵母QOR基因过表达工程菌实验室构建保藏；YPD 液体培养基（20 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，10 g·L-1酵母提取物）青岛海博生物技术有限公司。

1.1.2 试剂与仪器

HDMF 标品美国Sigma 公司；甲醇、乙腈和甲酸为色谱级山东浩中化工科技有限公司；对苯二酚（99%）和1，4-萘醌（98%）均为分析纯上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、氯仿和异丙醇均为分析纯青岛市捷盛化工物资有限公司；次甲基蓝上海正剂化工科技有限公司；TRIzol 美国Invitrogen 公司；RNA逆转录试剂盒日本东洋纺公司。

LDZM 立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2G 超净工作台苏州净化设备有限公司；HZQ-QX 台式高速离心机湘仪离心机仪器有限公司；YKSD-1000 倒置显微镜上海永科光学仪器有限公司；CFX96TM 实时荧光定量PCR 仪器美国Bio-Rad 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化及培养

参考周亚男等[8]方法并稍作改动。取冻存的鲁氏酵母QOR基因过表达工程菌菌株干粉，无菌条件下接入100 mL YPD 液体培养基中，在全温振荡器中28 ℃、180 rpm 条件下培养3 d，测定细胞总数达到2.5～3.0×108CFU·mL-1备用。

1.2.2 对苯二酚和1，4-萘醌浓度与作用时间对鲁氏酵母菌合成HDMF 的影响

配置1、10、50 和100 μg·mL-1的对苯二酚，分别利用有机过滤膜过滤后加入到灭菌的YPD 液体培养基中，再将活化的鲁氏酵母原菌和工程菌按5%比例接种到不同浓度对苯二酚溶液的YPD 培养基中，以不加对苯二酚溶液的YPD 培养基作为对照，在28 ℃和180 rpm 进行培养，以HDMF 产量为指标筛选对苯二酚最优浓度。配置1、10、50 和100 mg·L-1的1，2-萘醌，按上述条件进行1，2-萘醌浓度的筛选。在灭菌的液体培养基中加入筛选的对苯二酚和1，4-萘醌浓度，将活化至相同菌数的鲁氏酵母原菌和工程菌按5%分别接种到培养基中，于28 ℃和1 80 rpm 条件下，分别培养0～7 d。用移液枪精确量取菌液2 mL，8 000 rpm，离心10 min，取上清液过0.22 μm 滤膜后，分析HDMF 产量，筛选作用时间。

1.2.3 指标测定

QOR 基因相对表达水平测定使用Primer 5.0软件设计引物（表1），以PGADH作为内参基因合成引物（上海生工生物技术公司合成）。将鲁氏酵母原菌和转化后的QOR工程菌同时活化到细胞总数达到2.0～2.5×108CFU·mL-1，取5%活化后的菌液加入100 mL 灭菌后YPD 液体培养基中（原菌为对照组，QOR工程菌为处理组）。将培养的鲁氏酵母菌悬液于4 ℃，12 000 rpm 离心3 min，弃上清，将菌体于液氮中研磨至白色粉末状，并装入到1.5 mL Eppendorf 管中，利用Trizol 法提取RNA[9]。将提取的酵母RNA 利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 试剂盒进行反转录。为了保证后期qRT-PCR的质量，对上一步得到的cDNA 进行普通PCR 验证，选择GAPDH作为内参基因。将反转录后的cDNA 使用THUNDERBIRD SYBR ? qPCR Mix 试剂盒进行qRT-PCR 反应。PCR 程序设置为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，共39 个循环[10]。设定YPD 组中0 d 的GAPDH表达量为1，分别测定转录组挖掘的碳代谢通路待测基因表达量，每次测试设3 个生物学重复，3 个技术性重复。采用2-ΔΔCt计算相对表达量。分别在培养0～7 d 后取样，测定QOR基因的相对表达水平。

表1 主要引物序列设计Table 1 Main primers sequence design

HDMF 产量测定参考Li 等[11]方法。取培养后的发酵液在4 ℃条件下8 000 rpm 离心10 min，精准吸取2 mL 上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后采用HPLC测定HDMF 含量：UPLC BEH-Amide（1.7 μm，2.1×100 mm）；流动相0.5%甲酸和乙腈；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长287 nm。将1 mg·L-1的HDMF 标准液分别稀释制成2、5、15、20、40 和80 mg·L-1的HDMF 标准溶液备用，在上述条件下制定HDMF 标准曲线，对各发酵液组别的HDMF 进行定量。

菌落形态及活细胞数测定取培养0～7 d 的发酵液置于载玻片上，用次甲基蓝对其染色，在光学显微镜下观察，确定对苯二酚和1，4-萘醌对酵母菌细胞形态的影响。发酵液中菌数测定采用血球计数法[12]。

1.3 数据处理

所得数据均重复测定3 次，用平均值±标准差来表示。利用统计学软件SPSS25.0、Graphpad Prism 8.0 进行分析作图，采用单因素方差分析比较各组间数据，t检验法分析组间差异显著性，P＜0.05 表示实验组间数据差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对苯二酚和1，4-萘醌浓度对鲁氏酵母菌合成HDMF 产量的影响

在微生物培养基中添加外源底物、电子受体或相关碳源，可通过电子受体等方式促进NADH 氧化进而维持还原能力的平衡[13]。NQO1 催化醌类还原发生反应使醌类及其衍生物降解，减少细胞损伤，也可催化醌双电子还原为对苯二酚[14]。在鲁氏酵母菌中添加外源底物FBP，与呋喃酮合成相关的糖酵解（EMP）和磷酸戊糖途径（PP）的关键基因和酶得到显著上调，促进HDMF 的合成[15]。但关于对苯二酚和1，4-萘醌为外源底物调控鲁氏酵母菌合成的研究鲜有报道。

以对苯二酚和1，4-萘醌为外源底物，探索其对鲁氏酵母菌代谢合成HDMF 产量影响，结果如图1所示。当对苯二酚的浓度为10 μg·mL-1时HDMF 产量最高，为3.2 mg·L-1；1，4 萘醌浓度为10 mg·L-1时HDMF 产量最高，为2.86 mg·L-1。两组实验组HDMF的产量均显著高于对照组（P＜0.05），说明添加适量浓度的对苯二酚和1，4-萘醌可以促进鲁氏酵母菌内QOR 催化反应生成HDMF。同时，对苯二酚组HDMF产量略高于1，4-萘醌组，但两种外源底物如何参与调控NQO1 活性，促进HMMF 转化为HDMF 机制尚不明确。

图1 两种外源底物的浓度对HDMF 产量的影响Fig.1 Effects of two substrates concentration on HDMF production

2.2 培养时间对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母菌合成HDMF 产量影响

作用时间的延长，有助于外源添加物进入酵母菌生长和代谢体系，影响HDMF 的相关反应与合成。随着时间的增加，两种外源底物与酶促反应的效率会得到提升，可能为HDMF 合成产量起到促进作用。当对苯二酚和1，4-萘醌浓度分别为10 μg·mL-1和10 mg·L-1时，与对照组（0 d）相比较，添加对苯二酚后至3 d 时，HDMF 产量显著升高（P＜0.05），4～7 d后缓慢下降，在3 d 时含量达到最高3.2 mg·L-1（图2）；添加1，4-萘醌至5 d 时HDMF 产量显著升高（P＜0.05），6～7 d 缓慢下降，在5 d 时含量达到最高3.09 mg·L-（1图2）。

图2 培养时间对HDMF 产量的影响Fig.2 Effects of culture time on HDMF production

HDMF 的产量在发酵后期随着底物消耗而逐渐降低，这与李志江等[16]研究结果相类似，在豆酱中添加鲁氏酵母发酵后发现HDMF 含量在发酵后期逐渐降低并趋于平缓。

2.3 对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母菌QOR 基因表达量的影响

酚类化合物很容易被氧化，而多元酚则更容易被氧化，其产物为醌类化合物。醌类物质作为醌氧化酶的底物，有利于QOR催化反应并进一步促进HDMF 的形成[17]。在氧化应激条件下，醌氧化还原酶活性的增高，它的作用方式之一就是以HADPH 和FAD 为辅基，催化两个电子的反应，将异生质醌还原成氢醌，其底物通常是对位醌[18]，生成的氢醌随后会被后续的酶偶联，并排出体外以达到QOR基因过量表达。QOR也可以催化多种醌的还原反应，其中对于邻位醌和1，2-萘醌的催化效率最高[7]，因此实验选用对苯二酚和1，2-萘醌作为QOR底物调控鲁氏酵母工程菌产HDMF。

为了进一步验证外源添加对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母QOR过表达工程菌产HDMF 的影响，对其目的基因QOR相对表达量进行测定，结果如图3所示。添加对苯二酚培养至第3 天时，QOR基因相对表达量最高为5.02，与对照组相比较显著提升（P＜0.05）；添加1，4 萘醌培养到5 d 时QOR基因相对表达量为3.9（P＜0.05）。根据实验室前期研究结果可知，未添加该底物的培养基中QOR表达量在3 d 时产量最高为2.3 左右（课题组未发表数据）。因此，对苯二酚可以提高QOR相对表达量约2.2 倍；1，4-萘醌可以提高QOR相对表达量约1.7 倍。添加对苯二酚相比于1，4-萘醌的QOR表达量提高了1.3 倍。因此，通过添加两种外源底物，促进了鲁氏酵母菌QOR基因过量表达。

图3 两种底物对QOR 基因相对表达量的影响Fig.3 Effects of two substrates on QOR gene relative expression

图4 两种底物对活菌数量的影响Fig.4 Effect of two substrates on the number of live bacteria

2.4 对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母菌细胞数的影响

由文献可知，筛选10 μg·mL-1的对苯二酚浓度（0.01%）适于人体接受的作用剂量[19]，也低于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的安全剂量（0.044%）[20]，1，4-萘醌浓度达到10 mg·L-1时对真菌不存在显著致敏性[21]。因此，研究选用对苯二酚和1，4-萘醌适于本实验鲁氏酵母菌的外源底物，参与鲁氏酵母菌胞内QOR催化反应。

对添加对苯二酚与1，4-萘醌的鲁氏酵母QOR过表达工程菌进行细胞数的测定，显微镜下利用血球计数板测定活细胞数目（图5）。随着发酵时间的延长，两组活菌数均呈先增高后下降的趋势，加入对苯二酚活菌数在3 d 时最多，加入1，4-萘醌活菌数在5 d 时最多（P＜0.05）。李昕等[15]研究表明，鲁氏酵母活菌数目越高，产生的HDMF 越多，与上述实验结果相似。由此可知，添加对苯二酚与1，4-萘醌可以促进鲁氏酵母QOR过表达工程菌的生长。

图5 两种底物对细胞形态的影响Fig.5 Effects of two substrates on cell morphology

2.5 对苯二酚和1，4-萘醌对鲁氏酵母菌细胞形态的影响

尽管对苯二酚和1，4-萘醌能够促进鲁氏酵母细胞数目的增加，但也会对菌体形态造成潜在的影响。高浓度对苯二酚急性暴露处理酿酒酵母，通过增加活性氧导致菌体细胞凋亡调控基因、磷脂和中性脂水平高表达，抑制了酵母菌细胞生长[20]。1，4-萘醌可通过2 位羟基或甲氧基作用，与菌体细胞壁和细胞膜系统发生作用，破坏真菌细胞壁致死菌体[21]。

通过观察细胞生长形态可直观的比较外源添加底物对其产生的影响。取0、1、3、5、7 d 发酵液用次甲基蓝对其染色后，由于细胞浸于次甲基蓝溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶失活，不能产生脱色作用，被染成蓝色（图4 中呈黑色菌体）[22]。因此蓝色的死细胞不能再产HDMF，未被染色的活细胞可继续产HDMF。结果如图4 所示，加入两种外源底物后原菌及转化菌细胞均呈小圆形或椭圆形，聚集在一起，且死亡率低，这与Liu 等[23]研究中的鲁氏酵母细胞生长形态相一致。说明添加对苯二酚与1，4-萘醌对细胞的形态及活性未产生较大的致死影响，但致死率及抑制机制需要进一步研究。

3 结论

在鲁氏酵母QOR基因工程菌发酵培养基中分别加入对苯二酚和1，4-萘醌，测定发酵液中HDMF含量以及对菌体生长活性产生的影响。通过添加最适浓度的对苯二酚和1，4-萘醌，培养一段时间后发现，两实验组中QOR基因相对表达量均成倍数升高，QOR催化加速FBP 代谢合成HDMF。同时酵母活细胞数量增加，且菌体形态未发生改变。当外源酚类和醌类达到最佳添加量时，酚类产出HDMF 的含量是醌类的1.12 倍。研究证明利用外源酚类和醌类可作为QOR反应底物促进鲁氏酵母工程菌生产HDMF，但具体调控机制还有待考究。因此，外源添加对苯二酚和1，4-萘醌可在不影响鲁氏酵母工程菌生长时，提高HDMF 的产量，为今后实现低成本，高产量制备天然HDMF 提供一定的试验依据。