接菌剂对水稻秸秆和白菜尾菜混合堆肥进程及细菌多样性的影响

郭鹏博，温雪，张方政，张伟，徐一鸣，洪艳华，马金柱，魏丹，王伟东

（1.黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室/黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2 农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室；3 大庆油田水务公司水务环保研究院；4 北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所）

秸秆由于含有大量的木质纤维素类成分，因此在单一物料堆肥处理过程中降解速率缓慢。宋春丽等[1]研究发现，尾菜和秸秆等固体废弃物混合堆肥能够适当调节堆肥的初始含水率、碳氮比，一定程度上促进堆肥启动，提高堆肥品质。在白菜尾菜的好氧堆肥过程中，添加农作物秸秆等富含木质纤维类物质能够在完全腐熟后得到更为优质的堆肥产品[2]。在秸秆堆肥过程中，接种木质纤维素降解菌系可以促进堆肥过程快速启动，使堆肥达到更好的发酵效果[3]。龚建英等[4]通过接种微生物菌剂的方式对白菜尾菜和秸秆的混合堆肥进行处理，证明接种外源微生物能够显著提升物料的腐熟程度。水稻秸秆和鸡粪混合堆肥中添加外源氨氧化细菌可以促进堆肥快速启动，提升堆肥物料中的细菌群落多样性，进而促进形成腐殖质的形成[5]。实验室前期从堆肥体系中筛选、构建了秸秆分解菌剂能提高木质纤维素类物质的分解效率[6]。

关于接种外源真菌、细菌菌剂对堆肥进程影响的研究已有报道，关于寒区水稻秸秆与尾菜混合堆肥发酵、提高堆肥处理效率和堆肥质量微生物机制研究还有待深入。研究以自主研发的木质纤维素分解菌系为接菌剂，研究接菌剂对水稻秸秆和和白菜尾菜混合堆肥发酵的效果，明确秸秆分解菌剂对堆肥化过程中理化参数、腐熟度、细菌多样性的影响。本研究为水稻秸秆和白菜尾菜堆肥化处理提供理论依据，对实现水稻秸秆和白菜尾菜的无害化和资源化利用有指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所使用水稻秸秆取自黑龙江八一农垦大学农学试验基地，白菜尾菜收集于黑龙江八一农垦大学一食堂。水稻秸秆（经自然风干5～7 d）、白菜尾菜使用秸秆粉碎机（Xinhang，China）粉碎至3～5 cm 小段备用。秸秆分解菌剂为作者实验室自主制作，核心为木质纤维素快速分解复合菌系，菌系相关特性见文献[6]。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

实验分为试验组和对照组，试验组（T1）∶水稻秸秆和白菜尾菜按7∶3 的质量比混合，按堆肥体积的5%添加秸秆分解菌剂。对照组（CK）∶水稻秸秆和白菜尾菜按7∶3 的质量比混合，按堆肥体积的5%添加121 ℃高温高压灭活的秸秆分解菌剂。水稻秸秆和白菜尾菜充分混合后调节含水率至60%～65%，堆体为初始高1.2 m，直径2.2 m 的圆堆，起始体积为1.52 m3，试验共持续42 d。堆肥高温期每隔3 d 进行一次人工翻堆，堆肥降温期每隔7 d 进行一次人工翻堆。

分别取两种堆肥处理的初始物料以及在第3、7、14、21、28、35、42 天进行取样，取样方法选用多点混合法取样[7]，取回的样品分为两部分，一部分风干用于理化参数分析，另一部分液氮速冻后于-80 ℃超低温保存箱中保存，用于分子生物学分析。

1.2.2 理化参数的测定

在堆肥试验期间，每天13：00 时测定堆体中心温度及堆肥试验周边环境温度，测量仪器为笔式温度计（MITIR，China）。将新鲜样品置于105 ℃的电热鼓风干燥箱（Boxun，China）中烘干8 h，利用失重法测定样品含水率[8]。pH 采用pH 检测器（Horiba，Japan）进行测定[9]。有机质含量采用重铬酸钾容量法进行测定[8]。全氮含量测定利用凯氏定氮法，采用凯氏定氮仪（Hanon，China）对堆肥原料全氮含量进行测定[8]。全钾含量利用火焰光度法，采用火焰光度计（Yidian，China）进行测定[8]。利用燃烧氧化-非分散红外法，采用元素分析仪（Analytikjena，Germany）对堆肥物料总有机碳含量进行测定[9]。种子发芽指数采用籽粒发芽法进行测定[10]。木质纤维素含量采用纤维素测定仪（Velp，Italy），并利用Van Soest 方法确定木质素、纤维素和半纤维素的含量[11]。

1.2.3 细菌多样性分析

高通量测序的样品选取试验组和对照组处理的初始物料，高温期，降温期及腐熟期物料，即第0、7、28、42 天的样品，分别命名为A0、A7、A28、A42 和C0、C7、C28、C42。

总DNA 提取采用改良的氯苯法[12]，细菌引物采用515F Modified，806R Modified，进行PCR 扩增。将纯化好的样品送至北京百迈客生物科技有限公司利用Illumina Miseq PE250 平台进行细菌多样性分析。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and their sequences

1.2.4 数据分析

采用Origin 2018 软件对样品的理化参数进行分析。使用Trimmomatic、Cutadapt（version 1.9.1）、FLASH（version 1.2.11）等软件得到高质量的序列用于生物信息学分析。使用IBM SPSS Statistics 26 分析实验结果的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中理化参数的变化

2.1.1 堆肥过程中温度的变化

如图1 所示，试验组和对照组温度随时间变化趋势一致，在堆肥试验第1 天，试验组与对照组均进入高温期（≥50 ℃）。试验组堆肥第4 天温度达到最高，为70.2 ℃，高温期共持续21 d。对照组堆肥第3天的温度达到最高，为65.6 ℃，高温期共持续15 d。随后堆体温度随环境温度变化逐渐降低，最终与环境温度趋于一致，堆肥过程中试验组温度显著高于对照组（P＜0.05）。

图1 堆肥过程中温度的变化Fig.1 Temperature change during composting

2.1.2 堆肥过程中pH 的变化

如表2 所示，在堆肥过程中试验组和对照组pH均呈现先降低后升高的趋势。两组堆肥的pH 变化均在碱性范围内且变化幅度较小，始终维持在7.4～8.5之间。

表2 堆肥过程中pH、有机质、总有机碳、全氮、全钾的变化Table 2 Changes of pH，organic matter，total organic carbon，total nitrogen and total potassium in composting process

2.1.3 堆肥过程中有机质的变化

如表2 所示，两组堆肥物料中的有机质含量在前期快速下降，在21 d 之后逐渐稳定。堆肥初始物料的有机质含量为60.1%，试验结束时，试验组有机质含量下降至37.5%，对照组有机质含量下降至44.3%，试验组的有机质含量变化较快，且总量显著低于对照组（P＜0.05）。

2.1.4 堆肥过程中总有机碳的变化

如表2 所示，堆肥过程中物料总有机碳含量在前期迅速下降并趋于稳定，试验组总有机碳含量显著低于对照组（P＜0.05）。两组堆肥在试验初期总有机碳含量均为277.7 g·kg-1，试验组总有机碳含量在21 d时趋于稳定，下降至227.0 g·kg-1；对照组的总有机碳含量在28 d 时趋于稳定，下降至230.2 g·kg-1。

2.1.5 堆肥过程中全氮的变化

如表2 所示，堆肥过程中全氮含量变化逐渐升高最终趋于稳定。两组堆肥初始物料中全氮含量均为0.95%，在堆肥结束时，试验组的全氮含量为1.39%，对照组的全氮含量为1.31%。

2.1.6 堆肥过程中全钾的变化

如表2 所示，堆肥过程中全钾含量呈现逐渐升高的趋势。堆肥初始物料的全钾含量为1.09%，在堆肥结束时，试验组的全钾含量为2.15%，对照组的全钾含量为1.99%。

2.1.7 堆肥过程中木质素、纤维素、半纤维素的变化

堆肥过程中物料木质素、纤维素、半纤维素含量的变化如表3 所示。三者均呈现先降低最后趋于稳定的趋势。在试验组中，堆肥初始物料的纤维素、半纤维素、木质素含量分别为48.28%、14.30%、16.57%，堆肥结束时分别下降至31.62%、11.08%、10.95%。对照组堆肥初始物料的纤维素、半纤维素、木质素的含量为47.85%，14.00%，16.57%，在堆肥结束时分别下降至36.43%、11.71%、12.20%。堆肥结束时试验组中纤维素、木质素、半纤维素的降解率显著高于对照组（P＜0.05）。

2.2 堆肥过程中腐熟度的变化

2.2.1 堆肥过程中碳氮比的变化

如表4 所示，堆肥过程中碳氮比的变化呈现逐渐降低最终趋于稳定的趋势，堆肥过程中试验组的碳氮比显著低于对照组（P＜0.05）。在试验中，两组堆肥的初始的碳氮比均为29.16，在堆肥结束时试验组碳氮比为15.79，对照组的碳氮比为17.03，对照组和试验组的碳氮比均呈现逐渐降低的趋势。

表4 堆肥过程中碳氮比、种子发芽指数（GI）的变化Table 4 Changes of C/N ratio and seed germination index（GI）during composting

2.2.2 堆肥过程中种子发芽指数的变化

如表4 所示，对照组和试验组的种子发芽指数均呈现逐步升高的趋势，两组堆肥初始物料的种子发芽指数均为41.9%，在堆肥末期，试验组堆肥物料的种子发芽指数为81.2%。对照组的种子发芽指数最终上升至73.2%，试验组腐熟情况更好。

2.3 堆肥过程中的细菌多样性的变化

2.3.1 细菌门的组成和相对丰度

从细菌门水平丰度和组成情况来看，如图2 所示，在添加秸秆分解菌剂的试验组中，相对丰度大于1%的门分类水平菌有8 个，主要为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）等，其相对丰度之和在所有堆肥样品中超过95%。其中变形菌门丰度最高，在试验组中各时期的丰度分别为A0 （56.27%）、A7 （36.83%）、A28（31.42%）和A42（30.28%）。门分类水平上试验组和对照组的菌群组成相同，但各菌门的相对丰度及其在各时期具有显著差异（P＜0.05）。如图3 所示，在对照组细菌门水平上，变形菌门同样是相对丰度最高的优势菌门且同样呈现逐渐降低的趋势，由初始物料中的73.40%，堆肥结束时显著降低至36.72%（P＜0.05）。放线菌门相对丰度先逐渐升高最终趋于稳定，在高温期和腐熟期分别为15.02%（P＜0.05），21.17%（P＜0.05）。厚壁菌门的相对丰度随着堆肥试验的进行逐渐降低，在降温期和腐熟期分别为6.47%（P＜0.05）、3.29%（P＜0.05）。

图2 堆肥样品（T1）中细菌门水平丰度图Fig.2 The abundance chart at bacteria phylum level in compost samples（T1）

图3 堆肥样品（CK）中细菌门水平丰度图Fig.3 The abundance chart at bacteria phylum level in compost samples（CK）

厚壁菌门为秸秆分解菌剂的优势细菌门，试验组与对照组相比，在堆肥的各个时期厚壁菌门丰富度明显较高，尤其在高温期与降温期。在高温期，试验组与对照组厚壁菌门的丰富度分别为19.07%和10.03%，在降温期分别为19.75%和6.47%，试验组降温期的丰富度高于高温期。

2.3.2 细菌属的组成和相对丰度

在细菌属水平上，对照组和试验组各个时期的菌属组成和相对丰度均有显著差异（P＜0.05）。在试验组中，如图4 所示，相对丰度大于1%的属分类水平菌有8 个，主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、血杆菌属（Sanguibacter）、丛毛单胞菌属（Comamonas）等。在试验组堆肥原料中，相对丰度较高的菌属分别为假单胞菌属、丛毛单胞菌属、血杆菌属，进入高温期后，纤维杆菌属（Fibrobacter）、噬氢菌属（Hydrogenophaga）、Gemmatirosa的相对丰度较高。进入降温期后，噬氢菌属、Gemmatirosa、Demequina为主要的优势菌属，腐熟期的主要优势菌属为噬氢菌属、纤维弧菌属（Cellvibrio）和Demequina。

图4 堆肥样品（T1）中细菌属水平丰度图Fig.4 The abundance chart at bacteria genus level in compost samples（T1）

如图5 所示，对照组的细菌属水平上，相对丰度大于1%的主要优势细菌属有11 个，主要分为假单胞菌属（Pseudomonas）、高温双岐菌属（Thermobifida）、丛毛单胞菌属（Comamonas）等。在堆肥原料中的优势菌属分别为不动杆菌属（Acinetobacter）、丛毛单胞菌属（Comamonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）。进入高温期后，假黄单胞杆菌属、螯合球菌属（Chelatococcus）、Gemmatirosa的相对丰度均显著升高（P＜0.05），成为高温期的优势菌属。在降温期，Tagaea、高温双岐菌属、热多孢菌属（Thermopolyspora）成为主要的优势细菌属，高温双岐菌属和Gemmatirosa是堆肥腐熟期的主要优势细菌属。

图5 堆肥样品（CK）中细菌属水平丰度图Fig.5 The abundance chart at bacteria genus level in compost samples（CK）

2.4 细菌群落结构Alpha 多样性

2.4.1 细菌多样性指数

选取Simpson、Chao1、ACE 和Shannon 四个指数来分析堆肥过程中各个时期细菌的Alpha 多样性的变化。在97%相似度水平下，各样品Alpha 多样性指数值统计如表5 所示。在细菌类群上，试验组在高温期、降温期优势细菌属的多样性和丰富度显著高于对照组（P＜0.05）。在试验组中，高温期和降温期样品中的丰富度和多样性最高。在对照组中，腐熟期的细菌丰富度最高，但在各时期无显著性变化（P＞0.05）。降温期和腐熟期的细菌多样性显著高于原料和高温期（P＞0.05）。在试验组中，细菌的Chao1 和ACE、Simpson 和Shannon 指数总体上均呈现先升高后降低的趋势。在对照组中，细菌的Chao1 和ACE 指数未发生显著性变化（P＞0.05）。Simpson、Shannon 指数先降低后升高最终趋于稳定。

表5 堆肥样品中细菌类群分类Table 5 Classification of bacterial groups in compost samples

2.5 细菌群落结构Beta 多样性

如图6（A、B）所示，在细菌群落结构上，原料和高温期的样本各自聚类，距离较远，降温期和腐熟期距离较近。说明堆肥原料和高温期样品细菌的群落结构与其他时期相比差异较大，而降温期和腐熟期样品细菌的群落结构较为接近。

图6 堆肥样品的PCA 主成分分析。细菌的PCA 主成分分析（A：试验组，B：对照组）Fig.6 Principal component analysis of compost samples.Principal component analysis of bacteria（A：T1，B：CK）

3 讨论

3.1 接菌剂对堆肥过程中理化参数的影响

温度是堆肥过程中的重要参数，是直观表达堆肥物料腐熟度和腐熟速率的指标。试验中，对照组及试验组高温期均超过了15 d，且最高温度均超过65 ℃。接种秸秆分解菌剂的试验组堆体温度升高更快，同时高温期持续时间更长，证明秸秆分解菌剂可以促进堆肥过程启动，延长高温发酵时间，从而促进堆肥物料腐熟。堆肥前期，由于物料含水率较高，易降解的有机物被堆体内的微生物大量分解[13]，产生大量有机酸使pH 不断降低，在堆肥高温期微生物生长代谢活性增强，有机酸被分解和形成腐殖质[14]，同时含氮化合物分解产成NH3，由于NH3的积累导致pH 不断升高。研究中，试验组的有机质含量、总有机碳含量相比对照组变化较快，且总量显著低于对照组（P＜0.05），表明接入秸秆分解菌剂增强了易降解有机物、总有机碳的细菌活性，导致试验组中物料的有机质、总有机碳分解更加充分。研究中添加秸秆分解菌剂同样提升堆肥物料中的全氮、全钾含量，但是对全氮的提升效果并不显著，可能是堆肥过程中产生的高温导致全氮以氨气的形式大量挥发[15]。研究中，试验组的纤维素、木质素、半纤维素含量较对照组下降明显，其中纤维素的下降最为明显，证明秸秆分解菌剂可以有效分解堆肥物料中的木质纤维素的含量，且该菌剂中以分解纤维素的功能细菌为主。

3.2 接菌剂对堆肥过程中腐熟度的影响

碳氮比是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比值，是评价堆肥是否腐熟和稳定的重要参考指标，理论上堆体的碳氮比在15 左右时物料已完全腐熟[16]。堆肥结束时，试验组的碳氮比表明其堆体已经达到较好的腐熟效果，与对照组相比，试验组的碳氮比表明接种秸秆分解菌剂可以促进堆体的腐熟。种子发芽指数同样是衡量堆体物料腐熟的一项重要指标，当种子发芽指数大于80%后，证明堆体已达到完全腐熟[17]。试验中试验组的种子发芽指数已超过80%，原因为接种秸秆分解菌剂能够促进有机物分解为部分种子发芽所需的营养物质。

3.3 接菌剂对堆肥过程中细菌多样性的影响

与对照组相比，试验组中各个时期丰度均相对较高的细菌门为厚壁菌门，在高温期与降温期尤为明显。厚壁菌门是一类能在高温环境下存活的菌群[18]，添加的秸秆分解菌剂在微生物分类门水平上99%以上为厚壁菌门，证明接种的秸秆分解菌剂可以在堆肥的各个时期存活，进而发挥作用。与对照组相比，试验组中的假单胞菌属，纤维杆菌属，Demequina的含量相对较高。假单胞菌属对淀粉多糖类有机物具有较强分解能力，在堆肥前期大量出现[19]，但可能由于其不耐高温的原因，因此在高温期后丰度逐渐降低。纤维杆菌属在自然界中大量存在于在反刍动物的瘤胃中，在其细胞周质中有纤维素酶，具有分解纤维素的能力，试验组前期纤维杆菌属丰度较低，但随着时间推移其丰度逐渐升高，可能由于秸秆分解菌剂中具有的纤维杆菌随着时间的推移逐渐利用堆体内的营养元素从而大量增殖，进而发挥其分解纤维素的作用。

堆肥过程中细菌群落多样性越高，可能越有助于物料的分解。整个堆肥过程中试验组细菌群落的多样性始终高于对照组，且有机物的分解效率更高，原因为试验组中添加秸秆分解菌剂导致的，秸秆分解菌剂可以对堆体内细菌丰富度和多样性带来提升。

4 结论

添加秸秆分解菌剂能够促进水稻秸秆和白菜尾菜混合堆肥快速启动，延长堆肥过程中高温期时间，显著提高堆肥物料的养分含量，并促使物料达到完全腐熟。同时添加秸秆分解菌剂可以显著提升堆体高温期和降温期细菌的多样性和丰富度，提升了堆肥的最终品质。实验为生物法处理农业及粮食产业废弃物提供了理论依据及技术支持。