一起由金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的实验室检测分析

王 宇，国 霞，王 伟

（淄博市淄川区疾病预防控制中心，山东淄博 255100）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性致病菌且在自然界中广泛存在[1]。研究表明，每年的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件约占25%，已经成为我国引发细菌性食物中毒的主要致病因子之一[2]。蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种条件致病杆菌，易污染该菌的食物有米制品、乳类、熟肉、蔬菜及汤类等。被污染的食品外观一般无异常且无异味，容易被忽略，该菌可产生肠毒素，通常食用含菌量大于105CFU·mL-1（CFU·g-1）的食品即可引起人呕吐型或腹泻型食物中毒[3]。

1 材料与方法

1.1 样本来源

患者呕吐物2 份（编号1#、2#）；面包包装袋样本2 份、面包屑1 份、吃剩鸡腿样本1 份、鸡腿包装袋2 份、柠檬水1 份和可乐鸡米饭1 份，依次编号为3#～10#，以上采集样品均放置在无菌采样袋中。

1.2 仪器与试剂

GSP-9050 隔水式培养箱、JSH-250 生化培养箱、生物显微镜、生物安全柜、Baird-Parker（B-P）琼脂平板、沙门菌属显色培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP），均由青岛海博生物科技公司提供；营养琼脂均由北京陆桥公司提供；GP 生化鉴定卡；磷酸盐缓冲液（PBS）；A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素实时荧光PCR 检测试剂盒；Q5 型荧光定量扩增仪。

1.3 方法

1.3.1 检验方法

参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[5]对金黄色葡萄球菌进行检验；参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB /T 4789.14—2014）[6]对蜡样芽胞杆菌进行检验；参照《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[7]对沙门氏菌进行检验。

1.3.2 细菌培养

①将1#~10#样本前处理后无菌操作分别接种到7.5%氯化钠肉汤等相应的增菌液中增菌，后接种到对应的选择培养基（36±1）℃在培养箱培养24 h，观察结果。②处理好的样品匀液涂布于MYP 平板，置培养箱（30±1）℃培养24 h，观察菌落生长情况。增菌后的培养物接种到金黄色葡萄球菌B-P选择平板、沙门氏菌显色平板，于（36±1）℃培养24 h，观察结果。

1.3.3 涂片镜检

挑取适量可疑典型菌落涂片后固定，用革兰氏染色法染色后镜检。

1.3.4 生化实验

挑取纯培养的菌落分别进行相应的生化实验验证细菌种类。

1.3.5 PCR 检测

5#样本检出的金黄色葡萄球菌用PCR 方法测定肠毒素，取适量单个菌落金黄色葡萄球菌至离心管（生理盐水1 mL）中研磨，置离心机离心5 min（转速12 000 r·min-1），倒掉上清液，留取沉淀；加入DNA 提取液50 μL，用加样枪混匀沉淀使其悬浮，100 ℃温浴5 min，置离心机离心5 min（转速12 000 r·min-1），留上清液待测，使用Q5 荧光定量扩增仪，根据试剂盒说明书设定PCR 反应条件，FAM 通道采集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查情况

2021 年6 月4 日，淄川区疾病预防控制中心接到某医院急诊科报告疑似食物中毒患者2名，根据《食品安全事故流行病学调查技术指南（2012 年版）》[4]赶赴现场展开流行病学处置工作，两人为某校学生，于当日中午在学校宿舍共同进食芒果、网购包装鸡腿、网购面包、柠檬水和可乐鸡米饭，均有头晕、恶心、呕吐、腹痛和精神不佳等症状；呕吐约为3 次/h，1 例伴发热，体温37.6 ℃，平均潜伏期为3.6 h。

2.2 增菌培养与分离结果分析

培养的增菌液和分离的选择平板基上可见5#、6#有可疑菌落生长，其他样本所检项目未检出。5#在Baird-Parker 显色平板上呈圆形、表面光滑、湿润，直径2 ～3 mm 的粉红色菌落，见图1，涂片染色后镜检可见革兰氏阳性的蓝色球菌，呈葡萄串状，血浆凝固酶试验阳性，检测结果是金黄色葡萄球菌；6#在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂上培养后长出微粉色典型菌落，菌落周围有沉淀环，见图2，涂片染色显微镜下见蓝色革兰氏阳性的杆菌，菌体中央有芽孢，为椭圆形，不膨出于菌体，呈链状排列，通过相应的生化实验结果鉴定为蜡样芽胞杆菌，见表1。5#通过PCR 检测肠毒素类型为A 型，见表2。

表1 金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌生化结果

表2 金黄色葡萄球菌肠毒素A-E 分型结果

图1 5#金黄色葡萄球菌 图2 6#蜡样芽胞杆菌

3 结论与讨论

根据现场流行病学调查情况、中毒病例临床症状判断、实验室微生物检测结果综合分析，证实本起事件为细菌性食物中毒，致病菌为金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌，是因网购食品储藏不当所造成的。金黄色葡萄球菌的最适生长繁殖温度为30 ～37 ℃。如果食品加工的任何环节被金黄色葡萄球菌污染，在合适的温度下，金黄色葡萄球菌会在短时间内大量繁殖并产生肠毒素，通过被污染的食物进入人体引起严重的食物中毒[8]。在常见的食源性致病菌中，蜡样芽胞杆菌也是其中之一，该菌引起的食物中毒事件时有发生，严重危害人们的健康[9]。此事件发生在夏季，正值高温季节，两名学生患者食用开封后未冷藏保存的网购面包和鸡腿，因细菌滋生导致食物中毒。建议卫生部门针对社区、学校、企业、养老院和托幼机构等重点场所加强食品健康知识宣传，提高预防食源性疾病的意识；监管部门加强对食品生产和流通行业的督导力度，及时发现安全隐患，从源头上减少食源性疾病的发生。

本文着重从实验室检测方面分析，采集的10 份样品中，仅在5#和6#食物样本中检测到致病菌，而中毒病例的呕吐物中未检测出可疑的致病菌。多年来，在我国的食源性疾病暴发事件中，致病原因不明的急性胃肠炎占20%左右[10-11]，临床症状的相似性导致事件的溯源难度变大，实验室检测尤为重要，实验室检验水平与食源性疾病病因查明密切相关，在开展食物中毒流行病学调查处置时，要注意样品采集和实验室检测的重要性，不断提高检验能力。本次事件的实验室检测多采用传统检验技术，但金黄色葡萄球菌肠毒素类型检测运用了PCR 技术，这也说明基层疾控机构在检验技术方面有了一定发展。随着分子生物学的发展，病原溯源已进入生物信息学时代，通过基因型、分子型或全基因组测序等方法获得更准确的结果，对食源性病原体进行鉴定和事件溯源[12]，这就需要不断学习更新专业技术水平，增强基层实验室的标准化建设，提高食源性疾病致病因子的检出水平，为食源性疾病的溯源提供更精准的技术支撑。