miR-124基于PI3K/Akt通路对脓毒症大鼠肾组织炎症和氧化应激的影响

谭晓, 黄建, 刘向东

湖北民族大学附属民大医院重症医学科,湖北恩施 445000

脓毒症是感染引起的器官功能障碍综合征,肾损伤是其常见的并发症,也是导致脓毒症患者死亡的主要原因[1]。炎症、氧化应激、凋亡、自噬、非编码RNA异常表达等与脓毒症肾损伤的发生发展关系密切[2]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)信号轴可调控细胞氧化应激、炎症、凋亡、自噬,且PI3K/Akt通路活化也参与脓毒症及肾损伤过程[3-4]。PI3K/Akt通路在脓毒症肾损伤病理过程中的调控作用还存在争议。研究报道,微小RNA(microRNA,miRNA)异常表达与脓毒症的发生有关[5]。miRNA中的miR-124在脓毒症肾损伤模型大鼠肾脏中处于低表达水平[6],提示miR-124可能与脓毒症肾损伤关系密切。本研究通过建立大鼠脓毒症肾损伤模型,探讨miR-124基于PI3K/Akt信号轴对脓毒症肾损伤的影响,为脓毒症肾损伤的靶向治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物、试剂及仪器

72只SPF级雄性SD大鼠6～7周龄,体质量200～220 g,购自北京北方艾特生物科技有限公司,生产许可证号为SCXK(京)2020-0005。本动物实验符合3R原则并经本院伦理委员会批准。

HE染色及TUNEL细胞凋亡试剂盒(上海吉至生化科技有限公司);miR-124激动剂(miR-124-agomir)及其阴性对照(agomir-NC)(艾博思生物);TRIzol试剂盒及qRT-PCR试剂盒(美国赛默飞公司);PI3K/Akt抑制剂(LY294002)(北京百奥莱博科技有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(B cell lymphoma-2 assaciated X protein,Bax)、Caspase-3、核转录因子(nuclear factor,NF)-κB p65及其磷酸化NF-κB p65(p-NF-κBp65)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白等抗体(美国abcam公司);谷胱甘肽过氧化氢酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)(上海彩佑实业有限公司)。

1.2 大鼠脓毒症肾损伤模型建立及分组

将72只SD大鼠均分为假手术组(不做任何处理)、模型组(造模成功后不做任何处理)、miR-124-agomir组(miR-124高表达腺病毒载体处理)、agomir-NC组(阴性对照空载体处理)、LY294002组(PI3K/AKT抑制剂处理)、miR-124-agomir+LY294002组(miR-124高表达腺病毒载体和PI3K/AKT抑制剂处理)。除假手术组外,其余各组均采用盲肠结扎穿刺法建立脓毒症肾损伤模型[7],并于造模成功后按各组相应给药处理。假手术组、模型组不做任何处理;miR-124-agomir组、agomir-NC组分别尾静脉注射50 μL/kg miR-124高表达腺病毒载体和阴性对照空载体混悬液,并腹腔注射等体积生理盐水[8];LY294002组腹腔注射10 mL/kg PI3K/AKT抑制剂LY294002;miR-124-agomir+LY294002组尾静脉注射miR-124高表达腺病毒载体和腹腔注射PI3K/AKT抑制剂LY294002;各组连续给药3天,每天1次。

1.3 大鼠行为学及肾功能观察

各组大鼠均于给药期间观察行为学变化,并统计死亡情况。于末次给药结束12 h后,取各组大鼠血清按照试剂盒检测肾功能指标肌酐(creatinine,Cr)及尿素氮(urea nitrogen,BUN)水平。

1.4 HE法检测肾组织病理变化

各组大鼠取血后,断头处死,取出左右两肾,右肾组织置于-80 ℃冰箱保存,左肾置于4%多聚甲醛中固定24 h后,进行常规透明、浸蜡、包埋处理后切成5 μm切片,取部分切片,按苏木精-伊红染色试剂盒说明书染色后置于镜下观察。

1.5 TUNEL法检测肾组织细胞凋亡

组织切片进行二甲苯清洗、梯度乙醇脱水、蛋白酶K及过氧化氢处理后,按TUNEL检测试剂盒说明书方法,滴加TUNEL反应液进行显色封片后置于显微镜下观察细胞凋亡情况,每张切片随机选取5个视野,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

1.6 qRT-PCR检测大鼠肾组织miR-124相对表达水平

肾组织于4 ℃冰箱中解冻后,按TRIzol试剂盒说明书取总RNA,再以总RNA为模板,反转录cDNA,反转录后依照qRT-PCR试剂盒(SYBR Green)说明书及PCR仪扩增。96 ℃ 110 s,96 ℃ 40 s、55～60 ℃ 40 s、76 ℃ 40 s,45个循环;76 ℃ 260 s后终止反应。miR-124以U6为内参,采用2-ΔΔCt算法计算miR-124相对表达水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,miR-124正向引物为5′-CACTCCAGCTGGGTAAGGCAACGCGGT-3′,反向引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′;U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7 Western blotting法检测肾组织氧化应激、炎症、凋亡和PI3K/Akt、Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达

取保存的肾组织,4 ℃冰箱解冻后剪取200 mg,用细胞核蛋白及浆蛋白抽提试剂盒说明书方法,提取细胞核中蛋白及细胞质中蛋白,取各组上清液按BCA试剂盒说明书操作测各组蛋白水平,取60 μg蛋白进行电泳、转膜后,室温下封闭1 h后,加入一抗PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、NF-κB、p-NF-κB、TNF-α、Nrf2、HO-1(1∶1 500)、β-actin及Lamin B内参抗体(1∶3 000),4 ℃摇床孵育过夜并加入羊抗兔二抗(1∶2000),在37 ℃条件下孵育1 h后,用增强化学发光法显色,以化学发光仪观察条带并拍照,并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达水平。其中除Nrf2检测细胞核中蛋白表达外,其余均检测细胞质中总蛋白表达。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠肾组织病理结果比较

假手术组大鼠饮食活动正常,无死亡。模型组、miR-124-agomir组、LY294002组、agomir-NC组、miR-124-agomir+LY294002组大鼠死亡分别为3、1、6、2、2只。HE染色结果显示,假手术组大鼠肾小球、肾小管结构正常;模型组大鼠肾小管上皮细胞肿胀及空泡变性严重,肾间质炎症细胞浸润明显;miR-124-agomir组大鼠肾小管空泡变性较轻,炎症细胞浸润较模型组减轻;LY294002组大鼠肾小管空泡变性及炎症细胞浸润较模型组进一步加重;miR-124 agomir+LY294002组及agomir-NC组肾组织上述病理损伤程度与模型组相近(图1)。

图1 各组大鼠肾组织病理结果(HE染色,400×)A为假手术组;B为模型组;C为agomir-NC组;D为miR-124-agomir组;E为LY294002组;F为miR-124-agomir+LY294002组。

2.2 各组大鼠肾功能指标的比较

与假手术组比较,其他各组Cr和BUN水平升高(P<0.05);与模型组比较,miR-124-agomir组Cr和BUN水平降低(P<0.05),LY294002组升高(P<0.05)。与miR-124-agomir组比较,miR-124-agomir+LY294002组Cr和BUN水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各组大鼠肾功能指标比较 μmol/L

2.3 各组大鼠肾组织细胞凋亡的比较

与假手术组比较,其他各组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124-agomir组细胞凋亡率降低(P<0.05),LY294002组升高(P<0.05)。与miR-124-agomir组比较,miR-124-agomir+LY294002组细胞凋亡率升高(P<0.05;图2)。

图2 大鼠肾组织TUNEL染色图(200×)和细胞凋亡水平A为假手术组;B为模型组;C为agomir-NC组;D为miR-124-agomir组;E为LY294002组;F为miR-124-agomir+LY294002组。a为P<0.05,与假手术组比较;b为P<0.05,与模型组比较;c为P<0.05,与miR-124-agomir组比较。

2.4 各组大鼠抗氧化应激相关蛋白比较

与假手术组比较,模型组SOD、GSH-Px蛋白表达降低(P<0.05),Nrf2及HO-1升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124-agomir组SOD、GSH-Px、Nrf2及HO-1升高(P<0.05);而LY294002组各指标降低(P<0.05)。与miR-124-agomir组比较,miR-124-agomir+LY294002组上述各指标降低(P<0.05;图3、表2)。

表2 各组大鼠SOD、GSH-Px、Nrf2、HO-1蛋白表达比较

图3 各组蛋白表达免疫印迹图A为假手术组;B为模型组;C为miR-124-agomir组;D为LY294002组;E为miR-124-agomir+LY294002组;F为agomir-NC组。

2.5 各组大鼠肾组织炎症及凋亡相关蛋白表达的比较

与假手术组比较,模型组miR-124表达降低,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表达升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124-agomir组miR-124、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达升高,p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表达降低(P<0.05);LY294002组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达降低,p-NF-κB p65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3升高(P<0.05)。与miR-124-agomir组比较,miR-124-agomir+LY294002组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.05),p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表达升高(P<0.05;图4、表3)。

表3 各组大鼠肾组织p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3蛋白表达比较

图4 各组大鼠肾组织p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3蛋白表达免疫印迹图A为假手术组;B为模型组;C为miR-124-agomir组;D为LY294002组;E为miR-124-agomir+LY294002组;F为agomir-NC组。

3 讨 论

脓毒症具有较高的发病率及死亡率,全世界每年将近70%患者因患脓毒症急性肾损伤而死亡[9-11]。

严重的炎症反应是脓毒症的主要病理特征,而肾脏为最易受炎症因子攻击的靶器官之一[12]。Fu等[13]发现,脓毒症早期最先释放的炎症因子TNF-α可引起炎症而进一步导致肾功能损伤,表现为血清Cr、BUN的持续升高。本研究用盲肠结扎穿刺法建立脓毒症大鼠模型后,发现大鼠出现死亡,血清Cr、BUN异常升高,并伴随肾组织病理损伤,TNF-α、p-NF-κB/NF-κB表达异常升高,提示脓毒症肾损伤模型造模成功。本研究结果显示,抗氧化因子SOD及GSH-Px表达在模型大鼠肾组织中表达降低,且肾组织细胞凋亡率及凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达异常高于假手术组,提示氧化应激及细胞凋亡也可能参与脓毒症肾损伤过程。

研究证实,miRNA可调节靶基因表达,参与炎症、氧化应激、细胞凋亡等过程,且与脓毒症肾损伤的发生关系密切[14-15]。Li等[6]在脓毒症模型大鼠肾组织中检测到miR-124表达下调。脓毒症血清中氧化物酶体增殖物激活受体γ升高会上调miR-124表达来抑制炎症反应[16]。本研究模型组大鼠肾组织miR-124表达异常降低,过表达miR-124后,大鼠死亡减少,肾功能障碍、肾组织炎性损伤、氧化应激、凋亡等明显较模型组改善,证实过表达miR-124可缓解脓毒症肾损伤进程。但miR-124的调控作用还需进一步研究。

PI3K/Akt通路是调控炎症、氧化应激、细胞凋亡的关键通路之一[3,17]。本研究模型组大鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达升高,而抑制PI3K/Akt通路活化后,大鼠死亡率增加,肾组织炎症、氧化应激、肾组织损伤及肾功能障碍也进一步加重。另外,在炎症因子及氧化应激刺激下,PI3K激活可通过磷酸化Akt,促进Akt下游传输信号蛋白Nrf2表达及入核活化,清除过氧化物蓄积及减少TNF-α等炎症因子分泌,而PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途径活化受miR-124的间接调控[18]。本研究结果显示,miR-124过表达可活化PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路,提示miR-124可激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途径活化降低脓毒症肾损伤,而这一作用可被PI3K/Akt通路抑制剂LY294002逆转。

综上所述miR-124可能通过激活PI3K/Akt通路发挥抗炎症、抗氧化、抗凋亡作用,改善脓毒症大鼠肾损伤进程。但脓毒症过程中还会引起肺、肝等器官的损伤,miR-124是否还靶向作用于肺、肝器官损伤而延缓脓毒症进程还需进一步研究。