miR-185/YWHAZ轴通过糖酵解调控NSCLC A549细胞凋亡

马建刚, 王冬, 谭维, 周凤, 张莉媛

陕西中医药大学第二附属医院呼吸内科,陕西咸阳 712000

肺癌是临床常见恶性肿瘤,尽管靶向治疗、化疗和新型免疫治疗技术已广泛应用,但其5年生存率仍然很低[1]。代谢重编程是癌症的标志之一[2],肿瘤细胞表现出不同代谢表型,其特征是糖酵解增加和氧化磷酸化减少。有研究发现,随肺癌进展,葡萄糖和脂肪酸的完全氧化显著减少,且与晚期癌细胞的乳酸排泄和3H-脱氧葡萄糖摄取增加同时发生,使细胞向糖酵解表型转变[3]。miRNAs在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的发生发展中起重要作用[4]。临床研究显示,miR-185在NSCLC中低表达,可抑制肺癌进展[5]。YWHAZ沉默的卵巢癌细胞明显抑制了糖酵解[6]。然而,miR-185和YWHAZ之间的关系及其对NSCLC细胞糖酵解的影响尚不明确,基于此,本研究探讨miR-185/YWHAZ轴通过糖酵解对NSCLC细胞凋亡的影响,为治疗肺癌提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

非小细胞肺癌A549细胞购自武汉博士德生物工程有限公司。所有miRNA mimics、miRNA inhibitor、siRNA和过表达质粒(合成NCBI号为NM_001135699.2的YWHAZ序列后插入PCDNA3.1载体)均由南京金斯瑞公司设计和合成,YWHAZ siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′,GFP siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′。PrimeScript RT-PCR试剂盒购自广州艾基生物技术有限公司。SYBR Premix Ex Taq购自北京斐乐生物科技有限公司。YWHAZ抗体购自深圳市益百顺科技有限公司。ECL试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。乳酸和NADH试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司。

1.2 细胞培养与处理

人NSCLC细胞系A549在1640培养基中37 ℃、5% CO2条件下培养至60%～80%融合。miR-185相关分组如下:①敲低对照组(转染无关序列);②miR-185敲低组(转染miR-185 inhibitor);③过表达对照组(转染无关序列);④miR-185过表达组(转染miR-185 mimics)。YWHAZ相关分组如下:①敲低对照组(转染siGFP);②YWHAZ敲低组(转染siYWHAZ);③过表达对照组(转染空载体);④YWHAZ过表达组(转染YWHAZ过表达质粒)。使用Lipofectamine3000将上述处理因素转染至A549细胞。糖酵解抑制剂90 μmol/L Phloretin、10 mmol/L Quercetin、2.3 μmol/L STF31、1.3 μmol/L WZB117、5 μmol/L Bromopyruvate、61 μmol/L 3PO、1.5 μmol/L Dichloroacetate、3 μmol/L Oxamic acid、13 mmol/L NHI-1处理A549细胞[7]。

1.3 实时荧光定量PCR

TRIzol法提取细胞总RNA,合成cDNA,采用SYBR Premix Ex Taq在7500 real-time PCR系统上进行实时荧光定量PCR。将cDNA稀释至1∶20,95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共45循环;40 ℃ 30 s。使用ΔΔCq法计算YWHAZ mRNA相对表达水平。引物序列YWHAZ正向5′-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3′,反向5′-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3′;GAPDH正向5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,反向5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

1.4 免疫印迹法检测YWHAZ

提取细胞总蛋白,每个样品孔添加50 μg总蛋白。用12%SDS-PAGE分离蛋白并转移到硝酸纤维膜上,5%脱脂奶粉封闭膜1 h,TBS洗涤缓冲液清洗2次,与YWHAZ(1∶10 000)、actin(1∶10 000)抗体4 ℃孵育过夜。TBS洗涤缓冲液洗涤后,添加二抗室温孵育1 h。用ECL试剂盒测定actin和YWHAZ蛋白条带。

1.5 乳酸、NADH水平的测定

根据文献[8]方法,使用乳酸和NADH检测试剂盒,酶标仪570 nm处测量乳酸和NADH光密度(optical density,OD)。

1.6 细胞凋亡水平的测定

A549细胞接种于6孔板上,采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)双重标记法检测细胞凋亡情况。无血清培养基诱导细胞凋亡后,收集所需细胞,PBS洗涤,用膜联蛋白结合缓冲液重新悬浮细胞。每100 μL细胞悬液中加入Annexin V 5 μL,室温孵育15 min。5 min后加入PI,流式细胞仪检测Annexin V和PI阳性细胞数量。

1.7 miRNA高通量测序

提取来自不同糖酵解抑制剂处理后A549细胞总RNA,反转录为cDNA以构建miRNA文库,并由RioBio测序。通过15%Tris-硼酸盐-EDTA聚丙烯酰胺凝胶获得18～40个核苷酸的小RNA。PCR扩增产物纯化后,使用Illumina Hi-Seq2500平台进行测序。采用RioBio将干净的数据与miRBase数据库中的数据进行比较,计算miRNA的相对表达。

1.8 荧光素酶报告实验

通过miRDB(http://mirdb.org/)与HumanTargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在线预测miR-185底物。A549细胞在24孔板上培养,每孔转染0.5 μg萤火虫荧光素酶报告质粒、0.5 μg β-半乳酸苷酶表达载体和等量对照质粒或miR-185 mimics。转染24 h后,检测A549细胞中的荧光素酶活性。

1.9 统计学分析

使用Prism 7.0进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析和事后q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 YWHAZ敲低或过表达效果及溶解曲线

A549细胞YWHAZ蛋白水平敲低YWHAZ后下降,过表达YWHAZ后上升(图1A)。实时荧光定量PCR检测YWHAZ的溶解曲线为单峰,说明用于检测的引物特异性高(图1B)。

图1 YWHAZ敲低或过表达效果(A)及溶解曲线(B)

2.2 糖酵解抑制剂对糖酵解酶、乳酸、NADH、细胞凋亡水平的影响

糖酵解抑制剂处理后,乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、人血小板磷酸果糖激酶(phosphofructokinase platelet,PFKP)和甘油醛-3-脱氢酶(phosphogluconate dehydrogenase,PGD)等糖酵解酶、乳酸和NADH水平均下降,细胞凋亡水平上升(P<0.05;图2)。

图2 糖酵解抑制剂对糖酵解酶、乳酸、NADH、细胞凋亡水平的影响a为P<0.05,与对照组比较。

2.3 miR-185对糖酵解酶、乳酸、NADH、细胞凋亡水平的影响

糖酵解抑制剂处理后,miRNA高通量测序发现有45种miRNA表达上调(图3A)。过表达miR-185时细胞乳酸、NADH水平下降,细胞凋亡水平上升;敲低miR-185时上述变化逆转(P<0.05;图3B、C、D、E)。

图3 miR-185对糖酵解酶、乳酸、NADH、细胞凋亡水平的影响A为miRNA高通量测序结果;B为miRNA过表达筛选影响乳酸的miRNA;C为敲低miR-185后乳酸柱状图;D、E为敲低或过表达miR-185后NADH和细胞凋亡柱状图。a为P<0.05,与对照组比较。

2.4 miR-185靶向YWHAZ促进细胞凋亡

miRDB和HumanTargetScan在线分析发现,有60个基因可能被预测为miR-185底物,但使用siRNA敲低上述60个基因后,仅敲低YWHAZ时A549细胞乳酸水平下降(P<0.05;图4)。过表达YWHAZ时细胞乳酸、NADH水平上升,细胞凋亡水平下降;敲低YWHAZ时上述变化逆转(P<0.05;图4)。过表达miR-185时,YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,敲低miR-185时上述变化逆转(P<0.05;图4)。此外,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻译区(UTR)(P<0.05;图4)。

图4 miR-185靶向YWHAZ促进细胞凋亡A为siRNA敲低筛选影响乳酸的关键基因;B为过表达YWHAZ后乳酸柱状图;C和D为过表达或敲低YWHAZ后NADH和细胞凋亡柱状图;E和F为敲低或过表达miR-185后YWHAZ的mRNA和蛋白水平;G为荧光素酶报告实验结果。a为P<0.05,与对照组比较。

3 讨 论

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤,肺癌患者的5年生存率仅为17.7%,主要是由于肿瘤的快速转移和局部复发导致[9-10]。因此,有必要深入研究肺癌发生和发展的潜在机制。本研究通过使用糖酵解抑制剂、miRNA高通量测序、遗传学方法鉴定了miR-185/YWHAZ轴在NSCLC细胞凋亡和糖酵解中的重要作用。

本研究发现,糖酵解抑制剂处理后,糖酵解酶、乳酸、NADH水平下降,细胞凋亡水平上升。代谢重编程是癌症的标志[2],能量代谢分为糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢[11-12]。在正常情况下,细胞主要通过有氧呼吸产生能量。当氧含量不足时,细胞进行糖酵解产生能量[13],这个过程称为无氧呼吸。与正常细胞不同,肿瘤细胞即使在有氧条件下也主要通过糖酵解产生能量,这种现象称为Warburg效应[14]。糖酵解的特点是生产能量快,效率低。肿瘤细胞的快速增殖需要快速能量消耗,同时,糖酵解产生的乳酸为肿瘤细胞创造了一个酸性环境,有利于肿瘤细胞的快速增殖和生长。因此,糖酵解抑制剂处理后,细胞乳酸水平下降并伴随了细胞凋亡水平上升。

本研究发现,过表达miR-185时,YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端UTR。miRNA是非编码的小RNA,长度为18～23个核苷酸,通过与mRNA的3′端UTR结合,在转录后调节基因表达[15]。因此,在NSCLC细胞中,miR-185通过靶向降解YWHAZ的mRNA来发挥其生物学功能。

本研究发现,敲低YWHAZ时A549细胞的乳酸、NADH、细胞凋亡水平上升。YWHAZ影响多种重要的细胞过程,例如代谢、信号转导、细胞凋亡和细胞周期调节[16]。临床研究证实,YWHAZ的过表达与多种肿瘤的预后呈负相关[17]。研究表明,YWHAZ调节细胞代谢过程[18]。例如,YWHAZ与6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶的心肌同工酶结合,表明YWHAZ参与调节糖酵解和代谢[19]。此外,人乳腺上皮细胞中YWHAZ的增加上调了LDHA表达,提高糖酵解活性并促进早期转化[20]。在YWHAZ过表达的人乳腺上皮细胞中敲除LDHA可显著降低糖酵解活性并抑制转化。因此,YWHAZ可能成为多种肿瘤的预后标志物和治疗靶点。

然而,本研究仍然有不足之处。首先,本研究只使用了一种细胞株A549,miR-185/YWHAZ轴是否在其他NSCLC细胞株发挥调控细胞凋亡的功能需要进一步验证。其次,本研究是细胞水平的研究,miR-185在体内是否抑制NSCLC糖酵解值得进一步探讨。糖酵解产生的乳酸为所有种类的肿瘤细胞创造了一个酸性环境,并促进了肿瘤细胞增殖,因此miR-185/YWHAZ轴是否在所有肿瘤细胞中发挥功能是下一步的研究方向。

综上所述,YWHAZ是促进糖酵解的关键分子,miR-185是抑制糖酵解的关键分子。糖酵解抑制后,NSCLC细胞凋亡水平上升。miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻译区,减少了YWHAZ的表达,促进了NSCLC细胞的细胞凋亡。以上提示,针对miR-185/YWHAZ轴NSCLC药物的筛选和开发具有一定的应用前景。