张学武, 郑茜玲, 刘继华
1.北京大学第三医院延安分院 延安市中医医院口腔科,陕西延安 716000;2.西安大兴医院耳鼻喉科,陕西西安 710016
口腔癌是发生在口腔部位的癌症,也是较常见的肿瘤之一[1],最常见的病理类型为鳞状细胞癌,约占口腔癌总体的90%[2]。因其发病部位较为隐蔽,发现时大多处于中晚期,故死亡率高,预后差[3]。研究表明,口腔癌的发生与长期嚼槟榔、吸烟等不良习惯有关[4]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可对基因的表达产生正向或负向的影响,进一步改变肿瘤的进展[5]。研究表明,miR-409-5p在癌症中高表达[6]。本文探讨下调miR-409-5p对口腔癌细胞增殖、迁移的影响。
收集本院确诊并手术的8例口腔癌患者的口腔癌组织及癌旁正常组织。所有患者术前均未接受放疗、化疗、靶向或内分泌等辅助治疗。患者均签署知情同意书。qRT-PCR检测癌组织与癌旁正常组织中miR-409-5p水平。人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞系GNM、人口腔癌细胞SCC25、SCC-9、HN6购自上海细胞库,RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Hyclone公司,脂质体Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司,miRNA inhibitor、阴性对照购自上海吉玛基因有限责任公司,vimentin、β-actin一抗购于江苏亲科生物研究中心有限公司。
人口腔癌癌细胞GNM、SCC25、SCC-9、HN6均于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。细胞生长密度达到培养皿80%选取对数期生长状态较好的细胞传代培养。
取对数生长期生长状态较好的SCC-9细胞株种于六孔板,待密度达到60%根据转染说明书进行转染。筛选出确定细胞株后,按照对细胞的不同处理,将细胞分为3组:空白对照组(Lip2000处理的SCC-9细胞)、阴性对照组(Lip2000+阴性对照序列处理SCC-9细胞)、miR-409-5p组(Lip2000和inhibitor-miR-409-5p共同处理SCC-9细胞)。
以人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞系GNM作为对照,使用qRT-PCR筛选人口腔鳞癌细胞(SCC25、SCC-9、HN6)中miR-409-5p相对表达量最高的细胞株作为后续实验细胞。取接种于6孔板的4组细胞,在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中继续培养至细胞融合度达80%~90%时,弃培养基,每孔加入1 mL TRIzol,转移至无RNA酶的离心管中,加入氯仿200 μL,震荡15 min,室温静置15 min,4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取上层液体加入等体积异丙醇,12 000 r/min离心5 min。去上清液,加入75%乙醇1 mL,12 000 r/min离心5 min。去上清液,管内沉淀静置干燥5 min,加入焦碳酸二乙酯水溶解,分光光度计检测提取的RNA溶液水平,重复检测3次。各组细胞提取RNA后,按照试剂盒说明书合成cDNA,反转录条件37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。按照qRT-PCR试剂盒说明书操作,反应条件95 ℃10 min 1个循环;95 ℃5 s,60 ℃1 min 40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 1个循环。miR-409-5p正向引物:5′-AUGCAAAGUUGCUCGG GUAACCU-3′,反向引物:5′-CCAUCAGUCCCAAAU CCA-3′;GAPDH正向引物:5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物:5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′。以GNM细胞为对照,比较各细胞miR-409-5p的相对表达量,选取miR-409-5p表达最高的作为实验细胞。
取空白对照组、阴性对照组、miR-409-5p组细胞以每孔1×104的细胞数种植于96孔板,每组设置5个副孔,放入细胞恒温箱培养24 h后,以每孔15 μL加入四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液,放入37 ℃温箱孵育4 h,加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),30 min后测定490 nm波长光密度(optical density,OD)。细胞存活率(%)=(实验组OD/对照组OD)×100%,实验重复3次。
迁移实验:取空白对照组、阴性对照组、miR-409-5p组细胞以每孔数为2×105个加入小室中,每组细胞3个复孔。使用无血清培养基重悬于上室中,下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,于细胞恒温培养箱培养36 h后取出,观察细胞状态,棉签擦除未穿小室膜细胞后,PBS清洗2次,置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min后,取出风干后置入结晶紫溶液中,浸泡10 min后再次清洗,再次风干后显微镜下拍照。侵袭实验:将基质胶原液用无血清培养基稀释后以50 μL/孔加入小室上层中,注意不要产生气泡。放置恒温培养箱2 h,待基质胶凝固后重复迁移实验步骤。
各组细胞消化离心,在4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min,弃上清液,PBS清洗后细胞裂解液冰上裂解30 min后4 ℃过夜,次日离心30 min,取上清液。BCA试剂盒检测各组蛋白水平。3组蛋白取等量样品进行凝胶电泳,转膜后,快速封闭液封闭30 min,加入一抗稀释液进行孵育,4 ℃条件下摇床摇晃过夜。次日四聚丙烯(烷基)苯磺酸盐溶液清洗后加入二抗(山羊抗兔1∶5 000)稀释液孵育2 h,ECL试剂盒曝光显影。
各组细胞消化离心,PBS洗涤,离心5 min(1 500 g/min,4 ℃),取下层沉淀,依次加入1 mL TRIzol试剂、0.2 mL氯仿试剂,混匀后冰浴10 min,离心(12 000 r/min,4 ℃)15 min后取上清,加入1 mL异丙醇,冰浴半小时后离心取下层沉淀。检测沉淀的RNA水平后定量。vimentin正向序列:5′-GCTGCAGGCCCAGATTCA-3′,反向序列:5′-TTCATACTGCTGGCGCACAT-3′;GAPDH正向序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,反向序列:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。95 ℃ 65 s,58 ℃ 20 s,40个循环。
口腔癌癌组织中miR-409-5p相对表达量(1.35±0.05)较癌旁正常组织(1.01±0.04)明显增加(P<0.05)。
SCC-9细胞中miR-409-5p mRNA相对表达量(1.39±0.02)明显高于GNM细胞(1.00±0.04)、SCC-25细胞(0.52±0.02)、HN6细胞(0.90±0.02),差异均有显著性(P<0.05)。故选取口腔鳞状细胞癌细胞株中miR-409-5p mRNA相对表达量最高的SCC-9细胞为后续实验细胞。
与空白对照组和阴性对照组比较,miR-409-5p组细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降(P<0.05;表1、图1)。
图1 下调miR-409-5p对人口腔癌细胞SCC-9侵袭和迁移能力的影响(结晶紫染色,200×)
表1 3组SCC-9细胞增殖、侵袭和迁移能力比较 %
与空白对照组和阴性对照组比较,miR-409-5p组vimentin mRNA和蛋白相对表达量显著降低(P<0.05;图2、表2)。
图2 Western blotting法检测3组细胞vimentin蛋白相对表达量
表2 3组SCC-9细胞vimentin mRNA及蛋白相对表达量比较
miRNA是一种进化保守的非编码、碱基对较少的单链RNA,抑制基因转录或者使下游基因失活来调节蛋白质生成。研究表明,miRNA可靶向肿瘤基因组上脆性位点,使基因发生缺失、扩增或转位,进而调控相关基因转录以及翻译、控制癌细胞发生、发展[7-8]。miR-146a可调节鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性[9];miR-365-3p可通过抑制CDK-10的表达对口腔鳞癌细胞增殖、凋亡和周期产生影响[10]。
miR-409-5p在不同癌症中其作用不同。王睿等[11]发现,过表达miR-409-5p可下调肝癌细胞系HepG2增殖及迁移能力。miR-409-5p在乳腺癌组织和细胞中表达均上调,下调后可通过调节Ras抑制蛋白1来抑制细胞增殖及迁移能力[12]。本文结果显示,miR-409-5p在口腔癌组织及口腔癌细胞中表达上调,可抑制口腔癌细胞增殖、侵袭、迁移。
细胞从上皮状态转变为间充质状态被称为上皮间充质转化[13]。上皮间充质转化在改变细胞间质表型过程中发挥了重要作用,其主要作用为改变肿瘤细胞极性、切断肿瘤细胞与基底膜之间的粘连,同时使肿瘤细胞具备抵抗凋亡、降解细胞外基质的特性,从而使肿瘤细胞获得较强的侵袭和迁移能力[14]。而vimentin蛋白为中间丝蛋白,作为上皮间充质转化发展过程中的关键蛋白,对恶性肿瘤的发生发展密切相关,其上调可加速癌症的发展,在肿瘤细胞侵袭迁移和维持细胞正常形态方面具有重要作用,包括加速其转移、生长等[15-16]。本研究结果显示,下调SCC-9中miR-409-5p后vimentin表达下降,进而抑制上皮间充质转化。
综上所述,下调miR-409-5p能够抑制细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能与下调vimentin进而抑制上皮间充质转化有关,从而为口腔癌的诊断和治疗提供新的思路。